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大家新年快樂呀！今天小編給大家?guī)硪黄?3年1月份剛剛發(fā)表在GUT雜志（IF：31.793）上的文章“Distinct single- cell immune ecosystems distinguish true and de novo HBV- related hepatocellular carcinoma recurrences”。文章主要研究了不同復發(fā)肝細胞癌的單細胞免疫生態(tài)系統(tǒng)。
肝細胞癌是一種世界范圍內常見的癌癥，其5年生存率僅為18%。切除后的高復發(fā)率(5年內高達70%)是肝細胞癌（HCC）長期生存的重要障礙。更好地了解復發(fā)性肝癌的腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)對于在這種侵襲性疾病的早期階段治療至關重要。
肝細胞癌患者可能會經(jīng)歷真正的腫瘤復發(fā)(由原發(fā)腫瘤擴散引起，治療后<2年)或新發(fā)癌癥(從受損的肝實質新生，治療后>2年)。然而，復發(fā)與新發(fā)TIME的特征仍不清楚。對兩種類型的復發(fā)肝癌的免疫生態(tài)系統(tǒng)進行解剖，可以對這兩種肝癌之間免疫逃逸機制的異質性提供新的見解。
作者收集了20例初治復發(fā)性肝癌患者的23例腫瘤標本和11例配對的癌旁肝組織(NAT)，表征了兩種不同類型的復發(fā)肝癌的基因組圖譜和TIME，進一步解析復發(fā)肝癌的免疫微環(huán)境，及其免疫逃逸的機制。包括全外顯子組測序(WES)、scRNA-seq、Bulk RNA-seq、多重免疫熒光(IF)、流式細胞術和體外功能分析。
使用患者的腫瘤和NAT樣本進行了WES。根據(jù)對原發(fā)和復發(fā)腫瘤樣本的突變分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了兩種復發(fā)類型(圖2C，D)。新發(fā)肝癌在臨床上被定義為切除后2年以上的復發(fā)。然而，這項研究中，12例新發(fā)的肝癌中有8例在2年內發(fā)生并在兩個驗證隊列中都得到了證實(圖2E)。兩年內的復發(fā)可能是由于原發(fā)癌細胞擴散到肝實質，在相當一部分病例中也可能是新生腫瘤。
考慮到早期擴散的可能性，作者構建了一個模型來追蹤肝內轉移的動力學。首先，對原發(fā)和復發(fā)腫瘤的突變進行了癌細胞分數(shù)(CCF)分析，以確定轉移模式。CCF分析顯示了兩種類型的克隆性轉移(圖3A)。
應用SCIMET模型進一步推斷這些配對樣本的轉移時間。SCIMET算法假設轉移最初是由單個細胞播種的。從SCIMET模型推測的進化模式表明，PT01、PT15和PT16的復發(fā)腫瘤經(jīng)歷了嚴格的亞克隆選擇。相比之下，PT05、PT11和PT14的復發(fā)腫瘤傾向于在中性情況下發(fā)展(圖3B)。SCIMET模型顯示在這些患者中有較高的患者特異性突變率(u)?；谠谂鋵δ[瘤樣本中看到的體細胞突變的數(shù)量，進一步量化了當癌細胞開始擴散到肝臟其他區(qū)域(ND)時的原發(fā)腫瘤大小。這個時間點被定義為傳播的時間。此外，3/6例為遠處肝內復發(fā)(PT05、PT14、PT15)，提示腫瘤早期向原發(fā)灶遠處擴散。在驗證隊列中證實了這一發(fā)現(xiàn)(圖3C，D)。在所有病例中，據(jù)估計，當原發(fā)腫瘤體積小于1cm3時，早期擴散就已經(jīng)形成?？傊@些數(shù)據(jù)表明，即使在完全切除原發(fā)腫瘤的情況下，從原發(fā)肝癌早期種植也可能導致快速復發(fā)(圖3E)。
對23例復發(fā)的腫瘤樣本和11例NAT樣本進行了scRNA-seq分析。經(jīng)過質量控制和篩選，獲得了317558個高質量細胞。聚類為4個主要簇和43個細胞亞型(圖4A,B)。免疫細胞包括T細胞/固有淋巴樣細胞、髓系細胞、中性粒細胞、漿細胞樣樹突狀細胞(PDCs)、B細胞、漿細胞和肥大細胞；非免疫細胞的大部分為惡性細胞(圖4A，B)。
髓系細胞可重新聚為13個簇，包括7個巨噬細胞簇，3個DC簇，2個單核細胞簇和1個周期細胞簇（圖4D）。所有髓系細胞亞型中，只有DC2和mregDC在新發(fā)腫瘤中的比例略高于復發(fā)肝癌，DC1的比例相似。流式細胞術顯示在新發(fā)腫瘤中mregDC的比例顯著高于復發(fā)的腫瘤，新發(fā)腫瘤中DC1和DC2的比例有增加的趨勢(圖4F)。與復發(fā)的腫瘤相比，所有DC亞型(DC1、DC2和mregDC)在新發(fā)腫瘤中表現(xiàn)出更多的抗原處理和提呈、共刺激特征和分化特征(圖4G)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)顯示除DC外，其他的髓系細胞特征大致相似，在復發(fā)的肝細胞癌中，DC的比例和功能都降低了。
淋巴細胞亞群鑒定出19個簇，包括6個CD8+T細胞簇、2個NK細胞簇、5個ILC簇、2個CD4+T細胞簇、1個調節(jié)性T細胞(Treg)、na?ve T細胞(Tn)、T_MALAT1細胞和周期T細胞(圖5A)。在復發(fā)肝癌中，CD4+T細胞的比例低于新發(fā)肝癌。CD8+T細胞的比例呈現(xiàn)相反的趨勢圖5B，C)。
使用基于TCR的方法來識別和表征腫瘤特異性T細胞，將T細胞分為腫瘤特異性T細胞和腫瘤無關T細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性CD4+T和CD8+T細胞的克隆大小明顯大于腫瘤無關的CD4+T和CD8+T細胞，腫瘤特異性T細胞的克隆多樣性低于與腫瘤無關的T細胞(圖5D)。
通過比較兩種復發(fā)類型的腫瘤特異性和腫瘤無關T細胞，發(fā)現(xiàn)復發(fā)與新發(fā)肝癌相比，腫瘤特異性CD8+T細胞的豐度增加。相反，新發(fā)腫瘤中與腫瘤無關的CD4+T細胞比例增加(圖5E，F(xiàn))。
之后作者聚焦于腫瘤特異性CD8+T細胞。重新聚類檢測到5種腫瘤特異性CD8+T細胞亞型。CD8_Tem_GZMK_KLRB1和CD8_Tem_GZMK_CD27細胞在復發(fā)腫瘤中較豐富，CD8_Tex和CD8_Teff細胞在新發(fā)肝癌中較豐富(圖5H)。并使用流式細胞術分析得到了證實(圖5J)。
已有報道表明CD8+CD161+T細胞的細胞毒性作用減弱。因此用流式細胞術檢測了復發(fā)肝癌組織中CD8+CD161+T細胞和CD8+CD161-T細胞GZMB和IFN-γ的表達水平，證實CD8+CD161+T細胞具有較低的細胞毒活性(圖5L)。D8+CD161+T細胞可能處于弱細胞毒性和免疫抑制表型的記憶狀態(tài)。此外，結果還強調了復發(fā)和新發(fā)肝癌在TIMEs方面的其他差異，即新發(fā)腫瘤中CD8+T細胞豐度降低。
接著作者研究了腫瘤特異性CD8+T細胞的轉錄狀態(tài)和動態(tài)細胞轉變。首先，CD8+T細胞在新發(fā)的肝癌中上調CTLA4、CXCL13，提示一種耗竭和細胞毒性的T細胞表型。CD8+T細胞在復發(fā)肝癌中上調XCL1、EBES，表明為靜息記憶T細胞表型(圖6A，B)。此外，新發(fā)肝癌CD8+T細胞中的細胞毒性特征比復發(fā)樣本中的細胞毒性特征略有增加（圖6D）。
為了進一步證實兩種復發(fā)肝細胞癌中腫瘤特異性CD8+T細胞的不同免疫狀態(tài)，使用Monocle方法推斷了狀態(tài)軌跡。由于腫瘤特異性CD8+T細胞中沒有na?ve細胞，偽時序分析是從CD8_Teff細胞開始，通過以CD8_Tem_GZMK_CD27細胞為特征的中間效應記憶狀態(tài)，最終達到兩個終末狀態(tài)，一個是CD8_Tex細胞，另一個是CD8_Tem_GZMK_CD161細胞(圖6E)。在此過渡期間，細胞毒性分數(shù)減少，而耗竭分數(shù)增加(圖6F)。
接下來，分別研究了CD8+T細胞在復發(fā)和新發(fā)肝癌樣本中的軌跡。毒性CD8+T細胞主要出現(xiàn)在新發(fā)的腫瘤中，CD8_Tem_GZMK_CD161細胞主要出現(xiàn)在復發(fā)的肝癌中(圖6G)。新發(fā)肝癌中，CD8_Tem_GZMK_CD27細胞更可能向耗竭的CD8+T細胞狀態(tài)轉變。復發(fā)腫瘤樣本中，CD8_Tem_GZMK_CD27細胞顯示了兩種不同的路徑，一種過渡到衰竭狀態(tài)，另一種過渡到細胞毒性較弱的記憶狀態(tài)(圖5G)。
根據(jù)上述兩條軌跡路徑的分支點，將CD8+T細胞分為三個階段：分支前階段、Fate 1期、Fate 2期。分枝前階段的T細胞表達高水平的GZMB、GZMH、NKG7、PRF1 (圖6H)。Fate 1期，細胞高表達經(jīng)典檢查點基因和耗竭相關基因。Fate 1期富集在TCR信號通路和PD-1信號通路。CD8_Tem_GZMK_CD161細胞聚集在Fate 2期，與記憶表型一致，細胞毒性較弱。Fate 2期富集在免疫調節(jié)和FCGR3A介導的IL10合成（IL10可抑制CD8+T細胞GZMB或IFN的表達，抑制其活化和抗腫瘤功能），進一步證實了Fate 2期細胞毒性較弱。
在新發(fā)肝癌樣本中，CD8+T細胞主要駐留在分支前階段，并在Fate 1階段耗竭(圖6I，J)。相反，在復發(fā)肝癌樣本中，CD8+T細胞主要存在于Fate 2期，部分處于耗竭階段，這表明除了向衰竭過渡之外，CD8_Tem_GZMK_CD27細胞有一個獨特的發(fā)育程序，從CD8_Tem_GZMK_CD27細胞到相對靜止的記憶表型(圖6J)。
總之，對復發(fā)和新發(fā)肝癌樣本中CD8+T細胞分析顯示，在過渡軌跡中，CD8+T細胞處于不同的免疫和轉錄狀態(tài)。新發(fā)腫瘤樣本中CD8+T細胞具有細胞毒性和耗竭表型的特點。相反，復發(fā)的肝細胞癌樣本中，CD8+T細胞富含細胞毒性較弱的記憶T細胞。
細胞間相互作用發(fā)現(xiàn)，新發(fā)肝癌中與腫瘤特異性CD8+T細胞的耗竭呈正相關的前兩種免疫細胞亞型是巨噬細胞和mregDC(圖7A)。這些髓系細胞通過LGALS9與CD8+T細胞密切相互作用，并且在新發(fā)肝癌中作用更強(圖7B)。此外，LGALS9在新發(fā)肝癌的髓系細胞中的表達更高(圖7C)。多重IF還表明Galectin9+CD68+髓系細胞在TIM3+CD8+T細胞附近(圖7D)。這提示髓系細胞在肝癌復發(fā)時通過LGALS9和PD-L1軸耗盡CD8+T細胞的過程中起著重要作用。
同時作者檢查了復發(fā)肝癌TIEME內的細胞-細胞相互作用。由于Treg、巨噬細胞和其他免疫抑制細胞在兩種類型的復發(fā)中的比例相似，假設惡性細胞的差異是復發(fā)肝癌發(fā)生免疫抑制的原因。因此，首先確定了兩種復發(fā)肝癌之間的惡性細胞功能差異。在復發(fā)腫瘤中，肝癌細胞中免疫相關途徑如TNFα信號通路、IFN_Υ反應和IFN_α反應等均有豐富表達。相反，新發(fā)腫瘤的基因上調是與代謝相關的途徑，包括氧化-磷酸化和膽固醇穩(wěn)態(tài)(圖7E)。復發(fā)的腫瘤有更高的‘免疫逃逸’特征表達，而新發(fā)腫瘤表現(xiàn)出更高的‘氧化-磷酸化’特征表達(圖7F)。這些數(shù)據(jù)表明，在復發(fā)肝癌中，惡性細胞表型可能直接介導免疫逃逸。
免疫檢查點基因在肝癌細胞中的表達水平較低。因此，對這兩種復發(fā)類型惡性細胞的差異表達分析發(fā)現(xiàn)GDF15在復發(fā)肝癌中顯著上調(圖7G、H)。肝癌細胞和樹突狀細胞之間的相互作用已知會影響效應T細胞的抗原呈遞。惡性細胞和DC之間通過GDF15/TGFBR2、GDF15/CD48或GDF15/CD44的相互作用只發(fā)生在復發(fā)肝癌中(圖7I，J)。
體外功能實驗結果發(fā)現(xiàn)，在DC的抗原呈遞過程中，CD40、CD80和CD86這三種共刺激分子的蛋白水平在GDF15處理組顯著下調，這種作用可以通過使用抗GDF15中和抗體部分恢復(圖8A-C)。同樣，GDF15治療組的GZMB+CD8+T細胞比例顯著降低，相反，抗GDF15中和抗體增加了GZMB+CD8+T細胞的比例(圖8D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，GDF15可以抑制DC的抗原提呈和CD8+T細胞的細胞毒性，與GDF15的影響一致，在復發(fā)肝癌中，腫瘤特異性CD8+T細胞與DC之間的相互作用比新發(fā)肝癌少(圖8E)。
最后，作者評估了GDF15在肝癌細胞中的表達對預后的價值。GDF15的高表達與驗證隊列1中的肝癌患者的無復發(fā)生存期顯著縮短有關(圖8F)。綜上所述，GDF15+惡性細胞與DC的相互作用抑制了腫瘤相關抗原（TAA）的提呈，阻礙了T細胞的激活，并與復發(fā)肝癌預后不良有關。
新發(fā)和復發(fā)肝癌免疫抑制的不同模式(圖8G)強調了不同免疫治療策略的必要性。抗PD-1治療可能是新發(fā)肝癌更為合理的治療方案。作者檢查了正在進行的前瞻性第二階段臨床試驗的早期臨床數(shù)據(jù)，該試驗正在測試新輔助抗PD-1免疫療法對初步治療后復發(fā)的肝癌患者的療效。在這項試驗中，在11名入選患者中，兩名肝癌患者有反應(一名完全，一名部分)。但是，這兩個應答者的復發(fā)腫瘤被歸類為新發(fā)肝癌，而那些無應答者是復發(fā)肝癌。抗PD-1免疫治療對新發(fā)肝癌患者的反應與這種復發(fā)時T細胞的細胞毒性和耗盡的表型以及DC的相對正常功能是一致的。
相比之下，在復發(fā)肝癌中，抗PD1治療可能不能有效地誘導T細胞對腫瘤特異性的細胞溶解攻擊，因為它們處于靜止狀態(tài)，沒有腫瘤抗原的有效刺激。DC的抗原提呈功能受損和GDF15在復發(fā)肝癌細胞上的表達支持這一結論。
作者使用全外顯子組測序分析成對的原發(fā)和復發(fā)的肝癌樣本的突變特征和進化軌跡，確定了新發(fā)肝癌與復發(fā)肝癌，并分別刻畫了復發(fā)與新發(fā)肝癌的TIME。復發(fā)肝癌TIME的特點是KLRB1+CD8+T細胞增加，具有記憶表型和低細胞毒性。相反，細胞毒性和耗竭的CD8+T細胞在新發(fā)肝癌中有豐富的表達。轉錄和相互作用分析顯示，GDF15在靠近樹突狀細胞的肝癌細胞上表達增加，這可能抑制了抗原提呈，并抑制了復發(fā)肝癌的抗腫瘤免疫。相反，髓系細胞與T細胞的相互作用導致了肝癌復發(fā)時T細胞的耗竭和免疫抑制。新輔助抗PD-1免疫治療的第二階段試驗顯示，在新發(fā)肝癌患者中有更多的反應。
