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大家好！今天要介紹的這篇文章說新也不新，說普通也不普通。scRNA-seq、EGFR突變、免疫治療這三個(gè)詞大家都耳熟能詳，這篇文章將這三點(diǎn)充分揉合在一起，揭示了EGFR突變塑造的肺腺癌免疫抑制微環(huán)境是免疫治療效果差的因素之一。行文間無不體現(xiàn)作者是肺癌領(lǐng)域的深耕者，因此，研究肺癌的同學(xué)要好好研讀了！另外，常見基因突變對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響會(huì)不會(huì)成為你挖掘公共數(shù)據(jù)的思路呢~
文章標(biāo)題
背景知識(shí)
免疫療法對(duì)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者效果較差。其中，PD-L1低表達(dá)和腫瘤突變負(fù)荷是潛在機(jī)制。而腫瘤微環(huán)境(TME)是影響免疫治療的另一個(gè)重要因素，迄今尚未得到全面了解。因此，作者發(fā)起了這項(xiàng)研究，從細(xì)胞組成和功能的角度描述不同EGFR突變狀態(tài)下肺腺癌(LUAD)的微環(huán)境特征，以更好地了解其免疫情況。
結(jié)果解讀
肺腺癌的全局免疫景觀
為了評(píng)估EGFR突變的肺腺癌（LUAD）微環(huán)境的免疫景觀，作者從8名未接受過治療的LUAD患者收集了9個(gè)腫瘤樣本（5個(gè)EGFR陽性和4個(gè)陰性），用于單細(xì)胞RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析（圖1A）。兩個(gè)EGFR陽性樣本來自1名有多個(gè)結(jié)節(jié)的患者：一個(gè)為EGFRL858R，另一個(gè)為EGFR19del。
作者總共分析了40,799個(gè)單細(xì)胞，包括來自4個(gè)EGFR陰性樣本的18,704個(gè)細(xì)胞和來自5個(gè)EGFR陽性樣本的22,095個(gè)細(xì)胞，確定了八種主要細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、T/自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B/漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞。作者對(duì)每組和每位患者進(jìn)行了全局細(xì)胞類型注釋（圖1B、D和E）。微環(huán)境中這些細(xì)胞類型的比例在EGFR陽性組和EGFR陰性組之間存在顯著差異（圖1C，D）。
比較有意思的是，EGFR陽性和陰性組中，T/NK細(xì)胞均占主導(dǎo)地位，且存在相似的比例。然而，EGFR陽性組的單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例較高，而EGFR陰性組的中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞比例較高（圖1D）。
不同EGFR狀態(tài)的上皮細(xì)胞驅(qū)動(dòng)微環(huán)境的多樣性
總共獲得9067個(gè)上皮細(xì)胞，分成13個(gè)簇（圖2A）。作者使用R包infercnv將上皮細(xì)胞分為腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞（圖2D-D），并將>50%的腫瘤細(xì)胞群定義為腫瘤簇，將其他細(xì)胞群定義為正常簇。根據(jù)差異豐度測(cè)序（DASeq）分析，EGFR陽性組富集C1和C5，而EGFR陰性組富集C0、6、8和11。
富集分析結(jié)果顯示EGFR陰性組C6上調(diào)干擾素(IFN)α/γ響應(yīng)和PI3K-AKT-MTOR相關(guān)信號(hào)通路（圖2E）?；虮磉_(dá)分析顯示，CCL18、CXCL1和CXCL3在EGFR陽性特異性簇中的表達(dá)高于陰性特異性簇（圖2F），與免疫抑制相關(guān)。而EGFR陰性特異性簇C6表現(xiàn)出CXCL5、IL-7、IL-18和IL-32的高表達(dá)（圖2F）。IL-7是CD8+記憶T細(xì)胞增殖所必需的，而IL-18是活化CD8+ T細(xì)胞存活和產(chǎn)生IFN-γ所必需的。因此，野生型EGFR的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞增殖的能力。
作者進(jìn)一步將公共數(shù)據(jù)集中免疫治療后響應(yīng)和非響應(yīng)樣本的上皮細(xì)胞與本研究中EGFR陽性和陰性狀態(tài)的未治療樣本進(jìn)行比較，EGFR陽性特異性簇C1和5與來自非響應(yīng)患者的上皮細(xì)胞相同（圖2H）。這些結(jié)果與假設(shè)一致，即EGFR陽性LUAD可能對(duì)免疫治療反應(yīng)不佳。
軌跡分析顯示，EGFR突變驅(qū)動(dòng)正常上皮細(xì)胞分化為代謝特征不同的兩組：fate1（EGFR陰性組）或fate2（EGFR陽性組）（圖2I），說明代謝特征也可能對(duì)EGFR突變LUAD的微環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。
CD8+ TRM細(xì)胞在EGFR野生型LUAD中富集和激活，CD8+ TRM細(xì)胞可能通過CXCL13分泌促進(jìn)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的生成
作者把T和NK細(xì)胞分為CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞。接下來，CD8+和CD4+ T細(xì)胞分別分成9個(gè)和8個(gè)亞群（圖3A、C）。在EGFR陰性組中，CD8+ TRM細(xì)胞、CD8+循環(huán)T細(xì)胞、CD4+ TRM細(xì)胞和Th1樣細(xì)胞的比例較高（圖3B，D）。
CD103是TRM細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD103+ CD8+ TRM細(xì)胞與多種癌癥免疫治療后生存率的提高有關(guān)。此外，許多抑制性免疫檢查點(diǎn)，例如PD-1、LAG3和TIM3在TRM細(xì)胞中高度表達(dá)。mIHC結(jié)果顯示，EGFR陰性組中CD103+ CD8+ T細(xì)胞的比例更高（圖3E）。此外，EGFR陰性組CD8+ T細(xì)胞中PD-1、LAG3和TIM3的表達(dá)較高。在scRNA-seq數(shù)據(jù)中，抑制性和激活性免疫檢查點(diǎn)在CD8+ TRM細(xì)胞中都高表達(dá)，而EGFR陽性細(xì)胞中不存在這些免疫檢查點(diǎn)（圖3F）。這些結(jié)果表明，CD8+ TRM細(xì)胞在EGFR野生型LUAD的TME中富集，與mIHC數(shù)據(jù)一致。
作者進(jìn)一步研究T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)CXCL13在EGFR陰性組的CD8+ TRM中表達(dá)較高（圖3G）。CXCL13介導(dǎo)B細(xì)胞向腫瘤的募集，對(duì)于三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)的形成至關(guān)重要，其密度是幾種癌癥類型對(duì)免疫治療反應(yīng)的陽性預(yù)測(cè)因子。mIHC結(jié)果顯示，EGFR陰性組CD8+ T細(xì)胞中CXCL13的表達(dá)和TLS密度顯著高于EGFR陽性組（圖3E，H）；這種差異在基質(zhì)區(qū)域更為顯著，表明CXCL13可能促進(jìn)腫瘤基質(zhì)區(qū)域的TLS形成。
為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，作者分析了一個(gè)包含3個(gè)接受pembrolizumab治療的樣本的外部數(shù)據(jù)集。作者發(fā)現(xiàn)CD8+ TRM細(xì)胞在EGFR陰性組中的比例高于EGFR陽性組（圖3I-K）。在來自EGFR陰性組的每個(gè)樣本中都發(fā)現(xiàn)了CD8+ TRM細(xì)胞。此外，CD8+ TRM細(xì)胞是響應(yīng)性結(jié)節(jié)的主要CD8+ T細(xì)胞（圖3I-J）。因此，基線腫瘤組織中CD8+ TRM的富集可能是對(duì)ICI反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素之一。
巨噬細(xì)胞可能在EGFR陰性LUAD中募集和擴(kuò)增CD8+TRM細(xì)胞
作者將巨噬細(xì)胞分為8個(gè)亞群（圖4A、D）。EGFR陽性組肺泡巨噬細(xì)胞C1和C3的比例較高，而EGFR陰性組的CHIT1_TAM簇比例較高（圖4B）。DASeq分析表明EGFR陽性特異性區(qū)域與肺泡巨噬細(xì)胞C1和C3重疊，EGFR陰性特異性區(qū)域與CHIT1_TAM重疊（圖4C）。
基因表達(dá)分析顯示，EGFR陽性組巨噬細(xì)胞高表達(dá)CCL2、CCL13、GDF15、CCL23、CXCL17（圖4E），與EGFR突變的LUAD形成免疫抑制微環(huán)境有關(guān)。EGFR陰性組高表達(dá)CXCL9、CXCL10、CCL3、CXCL5、CXCL12，與抗腫瘤免疫響應(yīng)有關(guān)。
在評(píng)估免疫治療后的既往數(shù)據(jù)時(shí)，整合的巨噬細(xì)胞主要分為肺泡巨噬細(xì)胞和TAM（圖4F）。作者分析了治療后的TAM，響應(yīng)樣本的TAM特異性高表達(dá)CCL7、CXCL9和CXCL10，并與來自EGFR陰性初治組的TAM重疊（圖4G）。進(jìn)一步分析TAM發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的亞群CCL7_TAM（圖4H）。據(jù)報(bào)道，CCL7與人NSCLC腫瘤活檢中的CD103呈正相關(guān)，這表明EGFR陰性組中CCL7表達(dá)較高的巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)TRM擴(kuò)增。
CAF可能有助于在EGFR野生型LUAD將CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD8+ TRM細(xì)胞
成纖維細(xì)胞分為8個(gè)簇，并標(biāo)注為成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和CAF（圖5A、B）。CAF是TME的核心元素，并與癌細(xì)胞和TME的其他成分相互作用。作者將CAF分為肌纖維母細(xì)胞CAF(myCAF)、抗原呈遞CAF（apCAF）和炎性CAF(iCAF)（圖5C、D）。EGFR陰性組的apCAFs、myCAFs-1和myCAFs-2的比例高于EGFR陽性組。兩組iCAF的比例相似（圖5E）。DASeq還顯示apCAFs、myCAFs-1和myCAFs-2的分布與EGFR陰性特異性細(xì)胞的分布重疊（圖5F）。apCAFs的Hallmark分析顯示該簇富含促炎途徑（圖5G）。
對(duì)初治和治療后樣本的進(jìn)一步比較表明，在ICI治療后，成纖維細(xì)胞存在于非響應(yīng)樣本中，但很少出現(xiàn)在響應(yīng)樣本中。非響應(yīng)樣本中的主要和次要細(xì)胞分別是LEPR+ CAF和myCAF（圖5H，I）。因此，殘留的LEPR+ CAF可能會(huì)導(dǎo)致免疫耐受。LEPR是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的標(biāo)志物，LEPR+ CAFs可以被認(rèn)為是MSC樣CAFs。未經(jīng)治療的樣本中的iCAF和部分成纖維細(xì)胞與組合池中的LEPR+ CAF相關(guān)（圖5J）。進(jìn)一步分析表明，這些殘留的CAF特異性表達(dá)MMP2、CXCL14、CXCL12、FAP、TNFSF13B、BMP5和HGF（圖5K）。與免疫抑制和治療耐受有關(guān)。
TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于TME中MSCs分化為CAFs至關(guān)重要。作者發(fā)現(xiàn)EGFR陰性組的iCAF和myCAF比EGFR陽性組更能表達(dá)TGF-β。TME中豐富的TGF-β也可以誘導(dǎo)CD103在CD8+ T細(xì)胞表面的表達(dá)。因此，來自EGFR陰性組的CAF可能具有誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD8+ TRM細(xì)胞的能力。
B細(xì)胞在EGFR陰性LUAD的構(gòu)建TLS
B細(xì)胞分為10個(gè)簇（圖6A、B）。EGFR陰性組的漿細(xì)胞比例高于EGFR陽性組（圖6C）。免疫抑制因子CXCL17和GDF15的漿細(xì)胞表達(dá)在EGFR陽性組中較高，而與CAF激活有關(guān)的CCL18和GRN在EGFR陰性組中較高（圖6D）。
B細(xì)胞是TLS最重要和最基本的組成部分。細(xì)胞-細(xì)胞互作分析表明，B細(xì)胞可以通過與受體結(jié)合的各種細(xì)胞因子配體被CHIT1_TAM、iCAF和LAMP3+ DC募集（圖6E）。表達(dá)CCR7的B細(xì)胞可以通過分泌CCL21的CHIT1_TAM募集。EGFR陰性組的B細(xì)胞更高表達(dá)CCR7，同時(shí)CHIT1_TAM特異性表達(dá)CCL21（圖6F）。此外，與TLS形成的CD79A在EGFR陰性組的B細(xì)胞中比EGFR陽性組的表達(dá)更高（圖6F）。這些數(shù)據(jù)表明，來自EGFR陰性組的B細(xì)胞可能已被CHIT1_TAM募集，并有可能在TME中構(gòu)建TLS。
細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)因EGFR狀態(tài)而異
作者使用CellPhoneDB來研究LUAD微環(huán)境中的細(xì)胞間通信。細(xì)胞通訊類型因EGFR突變狀態(tài)而異。由于CD8+ TRM細(xì)胞可能是負(fù)責(zé)免疫治療療效的主要免疫細(xì)胞，作者分析了CD8+ TRM與其他細(xì)胞類型之間的特定相互作用（圖7A）。在EGFR陰性組中注意到CD8+ TRM細(xì)胞與CHIT1_TAM、LAMP3+ DC和成纖維細(xì)胞的相互作用。CHIT1_TAM可以通過CXCL9/CXCL10–CXCR3結(jié)合來吸引和激活TRM細(xì)胞。LAMP3+ DC可能通過EGFR陰性組中的IL-15和IL-15R結(jié)合促進(jìn)TRM擴(kuò)增和穩(wěn)態(tài)存活。同時(shí)，我們的EGFR陰性組中的成纖維細(xì)胞也通過TGFB2-TGFBR2和TGFB3-TGFBR3結(jié)合與TRM特異性相互作用，這對(duì)于CD8+ T細(xì)胞上調(diào)CD103以轉(zhuǎn)化為TRM細(xì)胞是必不可少的。
接下來，作者又分析了配體、受體及其在不同EGFR狀態(tài)的兩個(gè)細(xì)胞亞群之間的相互作用。作者發(fā)現(xiàn)一些配體-受體對(duì)在EGFR陰性組和陽性組中共享，另一些為則出現(xiàn)在EGFR陰性組或陽性組中。關(guān)于免疫檢查點(diǎn)配體-受體對(duì)，與EGFR突變LUAD相比，EGFR野生型的T細(xì)胞與其他細(xì)胞類型（包括PD-1和PD-L1）之間存在更特異性的相互作用（圖7B-D）。IHC結(jié)果顯示EGFR陽性組中免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)較低，包括PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、TIM3和CD47（圖7E）。值得注意的是，TIGIT在EGFR陽性組中表達(dá)更高，尤其是在基質(zhì)中，而其他免疫檢查點(diǎn)的模式則相反（圖7E）。這些結(jié)果可能會(huì)為EGFR突變LUAD的潛在免疫治療策略提供見解。
結(jié)束語
本文最大的亮點(diǎn)是作者將肺癌中常見的EGFR突變和免疫治療響應(yīng)結(jié)合起來，通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)整合分析，證明了EGFR陰性與免疫治療響應(yīng)樣本的共同特征。其中，以CD8+ TRM細(xì)胞（免疫響應(yīng)相關(guān)）為主線，其他細(xì)胞類型圍繞這條主線進(jìn)行詳細(xì)研究。
參考文獻(xiàn)
Yang L, He YT, Dong S, et al. Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma. J Immunother Cancer. 2022;10(2):e003534. doi:10.1136/jitc-2021-003534
