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Nature重磅 腫瘤微生物促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性
腫瘤相關(guān)微生物群是人類癌癥類型腫瘤微環(huán)境的內(nèi)在組成部分。到目前為止，腫瘤內(nèi)宿主-微生物群研究在很大程度上依賴于bulk組織分析，這掩蓋了腫瘤內(nèi)微生物群的空間分布和局部效應(yīng)。近期，Nature期刊一篇題為Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer的論文揭示了微生物促進(jìn)癌癥進(jìn)展的作用。
背景
在癌癥患者的腫瘤中，惡性細(xì)胞被復(fù)雜的非惡性細(xì)胞環(huán)境包圍，這些細(xì)胞可能具有促瘤或抗癌作用，具體取決于其細(xì)胞類型和豐度。體外和臨床前動物模型表明，腫瘤相關(guān)微生物群中的細(xì)菌在癌癥發(fā)展、轉(zhuǎn)移、免疫監(jiān)測、和化學(xué)耐藥性等方面發(fā)揮作用。有強(qiáng)有力的分子證據(jù)表明，至少33種主要癌癥類型存在腫瘤內(nèi)微生物群，并且腫瘤內(nèi)微生物群可以是細(xì)胞內(nèi)的。然而，這些微生物的確切身份以及與患者腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞的相互作用尚未完全揭示。此外，腫瘤內(nèi)微生物群的空間分布和特定的宿主-微生物細(xì)胞相互作用是否影響腫瘤微環(huán)境在很大程度上是未知的。本文研究了口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）和結(jié)直腸癌（CRC）中微生物和宿主細(xì)胞在空間水平的相互作用，揭示了腫瘤內(nèi)微生物群如何促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性。研究表明被細(xì)菌感染的癌細(xì)胞以單細(xì)胞的形式侵入其周圍環(huán)境，并將免疫細(xì)胞募集到細(xì)菌區(qū)域。腫瘤內(nèi)微生物群的分布不是隨機(jī)的，具有促進(jìn)癌癥進(jìn)展的免疫和上皮細(xì)胞功能。
結(jié)果一：腫瘤內(nèi)微生物群的異質(zhì)性
作者對11例CRC患者腫瘤的44個組織進(jìn)行了16S rRNA擴(kuò)增子測序，觀察到門和屬水平的腫瘤內(nèi)微生物群組成在個體患者腫瘤內(nèi)有所不同。基于β多樣性聚類和樹狀圖分析顯示，超過三分之一的評估患者具有相對穩(wěn)定的微生物組組成。然而，大多數(shù)患者在腫瘤內(nèi)微生物組中表現(xiàn)出不同程度的異質(zhì)性，這表明一部分患者的腫瘤組織中微生物分布不均勻。通過靶向RNA scope-熒光原位雜交成像確認(rèn)了包括梭桿菌等細(xì)菌群落的異質(zhì)空間分布，在同一腫瘤標(biāo)本中觀察到細(xì)菌細(xì)胞生物量密集區(qū)域/區(qū)室和細(xì)菌陰性區(qū)域，通過定量PCR和微生物組分析驗(yàn)證了RNAscope方法的結(jié)果。
為了進(jìn)一步了解腫瘤內(nèi)微生物群的空間分布和這些微生物的確切身份，作者通過10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法應(yīng)用于CRC標(biāo)本和OSCC標(biāo)本。每個捕獲的微生物轉(zhuǎn)錄本（主要由核糖體RNA組成）兩側(cè)都有來自10x Visium捕獲點(diǎn)的條形碼——寡核苷酸序列，為整個腫瘤組織中的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本提供空間坐標(biāo)。此外，來自單個微生物轉(zhuǎn)錄本的測序reads包含唯一的分子標(biāo)識符（UMI），這能夠量化這些組織切片中活生物體的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄負(fù)荷。使用GATK PathSeq評估所得測序reads在分類學(xué)上解析原位測序讀取到屬水平。在每個組織塊內(nèi)，靶向RNAscope-FISH的連續(xù)組織載玻片染色數(shù)據(jù)證實(shí)了這些腫瘤內(nèi)細(xì)菌的空間分布?？傮w而言，在口腔鱗狀細(xì)胞和結(jié)直腸癌腫瘤內(nèi)分別有28%和46%的捕獲點(diǎn)鑒定出細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本。對于檢測到細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本數(shù)目統(tǒng)計，每個捕獲點(diǎn)鑒定的不同細(xì)菌屬的數(shù)量范圍為1至42，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中中位數(shù)為8，在CRC腫瘤中為1至31，中位數(shù)為2。通過將這種空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法應(yīng)用于腫瘤內(nèi)微生物群，能夠直接識別、量化和空間映射患者組織學(xué)完整腫瘤組織中的活細(xì)菌，突出了這些腫瘤組織中腫瘤內(nèi)微生物群相互作用的復(fù)雜性。
結(jié)果二：腫瘤內(nèi)生態(tài)位的微生物定植
鑒于腫瘤內(nèi)微生物群在單個腫瘤組織中具有異質(zhì)性分布，作者試圖確定這種空間分布是否與腫瘤微環(huán)境內(nèi)的不同功能相關(guān)。通過GeoMx數(shù)字空間分析平臺量化了與抗腫瘤免疫和癌癥進(jìn)展相關(guān)的77種蛋白質(zhì)的表達(dá)譜。實(shí)施分段分析以富集感興趣組織區(qū)域的免疫或上皮細(xì)胞中提取到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)通過RNA scope-顯色原位雜交（RNAscope-CISH）注釋為細(xì)菌陽性或陰性。
在OSCC口腔鱗狀細(xì)胞癌和CRC腫瘤的CD45免疫細(xì)胞富集區(qū)域內(nèi)，細(xì)菌存在于高度免疫抑制的微生態(tài)位中，其特征在于成熟骨髓細(xì)胞富集以及免疫抑制分子ARG1和免疫檢查點(diǎn)蛋白CTLA4的上調(diào)。此外，在這兩種癌癥類型中，作者檢測到磷酸化ERK1和ERK2水平增加，這表明針對腫瘤內(nèi)細(xì)菌的骨髓反應(yīng)可能通過激活MAPK信號通路發(fā)生。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，與標(biāo)本中的細(xì)菌陰性區(qū)域相比，T細(xì)胞抑制受體PD-1在細(xì)菌陽性微生態(tài)中過表達(dá)。這對應(yīng)于口腔鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌組織中T細(xì)胞標(biāo)志物（如CD3，CD8，CD4，CD27和CD44）的相對下調(diào)，以及增殖標(biāo)志物KI-67的表達(dá)降低，并表明T細(xì)胞被排除在這兩種胃腸道癌癥的細(xì)菌定植區(qū)域中。
在兩種癌癥類型的PanCK+上皮腫瘤區(qū)域中，細(xì)菌定植區(qū)域的血管化程度低于細(xì)菌陰性區(qū)域。此外，作者還觀察到平滑肌肌動蛋白（SMA）的表達(dá)減少、細(xì)胞增殖水平較低。在口腔鱗狀細(xì)胞癌和CRC腫瘤組織的細(xì)菌定植區(qū)域中，作者檢測到腫瘤抑制因子p53的野生型構(gòu)型的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，表明細(xì)菌定位與TME內(nèi)高度轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞相關(guān)。此外，細(xì)菌定植的微生態(tài)位顯著增加了CRC腫瘤中JNK、ERK1、ERK2以及P38的磷酸化水平，從而揭示了響應(yīng)細(xì)菌而激活的信號通路。RNA scope和免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)的結(jié)合支持了之前的發(fā)現(xiàn)，即PD-1在口腔鱗片標(biāo)本的細(xì)菌陽性微生態(tài)位中過表達(dá)，此外KI-67水平顯著降低，這表明口腔鱗狀細(xì)胞癌和CRC腫瘤組織的感染區(qū)域比未感染區(qū)域具有更低的增殖潛力。
結(jié)果三：微生物驅(qū)動的單細(xì)胞異質(zhì)性
腫瘤微環(huán)境中的單個宿主細(xì)胞存在于一系列人類癌癥類型中。然而，幾乎沒有關(guān)于侵襲細(xì)菌的身份的報道。為了研究TME中的細(xì)菌-宿主細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用及其對宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響，作者通過引入靶向細(xì)菌16S rRNA保守區(qū)域的引物開發(fā)了INVADEseq方法，促進(jìn)了來自細(xì)菌相關(guān)人類細(xì)胞的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本的cDNA文庫的生成，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)菌群以梭桿菌屬(34%)和密螺旋體屬(29.8%)的細(xì)菌種類為主，并通過基因集富集分析(GSEA)證實(shí)。隨后研究者為了確定與細(xì)胞相關(guān)優(yōu)勢細(xì)菌屬是否會影響上皮信號通路。他們將梭桿菌或密螺旋體相關(guān)單細(xì)胞與上皮細(xì)胞群中的細(xì)菌陰性細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌陽性上皮細(xì)胞中，與癌癥進(jìn)展相關(guān)的基因表達(dá)和細(xì)胞信號通路受到輕微影響，梭桿菌和密螺旋體主要與這些患者腫瘤中的上皮和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞-v1（稱為巨噬細(xì)胞簇）相關(guān)。細(xì)菌感染的細(xì)胞表現(xiàn)出參與細(xì)菌感染反應(yīng)的信號通路的顯著上調(diào)，例如TNF通路、與炎癥和缺氧相關(guān)的通路，以及通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和p53信號通路影響癌細(xì)胞進(jìn)展。與來自未感染的對照簇的細(xì)胞相比，細(xì)菌感染的細(xì)胞也顯示出與有絲分裂紡錘體形成和G2-M DNA損傷檢查點(diǎn)相關(guān)的細(xì)胞周期信號通路的下調(diào)。然而，INVADEseq無法區(qū)分細(xì)菌是否正在主動入侵巨噬細(xì)胞還是巨噬細(xì)胞是否正在吞噬細(xì)菌?？偟膩碚f，研究者表明腫瘤內(nèi)和細(xì)胞相關(guān)的微生物群可以在免疫和上皮細(xì)胞群的單細(xì)胞水平上驅(qū)動患者腫瘤的異質(zhì)性。
在巨噬細(xì)胞細(xì)胞簇中，作者發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞通過激活TNF、INFγ和IFNα參與炎癥反應(yīng)的基因，以及通過JAK-STAT信號通路參與白細(xì)胞介素產(chǎn)生的基因，如IL1B、IL6和IL10的表達(dá)水平顯著增加。吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞也過表達(dá)趨化因子CCL2、CCL4、CCL8、CCL7、CXCL1和CXCL10。在分析與細(xì)菌相關(guān)的一般細(xì)胞時觀察到這種基因表達(dá)特征，以及在評估特定細(xì)菌屬（包括梭桿菌和密螺旋體）時也觀察到這種基因表達(dá)特征。此外，在標(biāo)本水平上，每個口腔小細(xì)胞標(biāo)本的細(xì)菌載量與強(qiáng)效中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘劑CXCL8呈正相關(guān)，與CD3E的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明瘤內(nèi)細(xì)菌定植的區(qū)域通過募集中性粒細(xì)胞和排除CD3+ T細(xì)胞，具有免疫抑制作用。
結(jié)果四：細(xì)菌誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移
為了評估腫瘤內(nèi)微生物群的主要成員與免疫或上皮癌細(xì)胞的直接相互作用，作者使用了共培養(yǎng)等方法發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)微生物群在患者腫瘤細(xì)菌定植的微生態(tài)中對中性粒細(xì)胞的富集有積極作用。中性粒細(xì)胞募集和保留到感染了具核梭桿菌的癌細(xì)胞微環(huán)境中，表明腫瘤內(nèi)微生物群在患者腫瘤的細(xì)菌定植微生態(tài)位內(nèi)的中性粒細(xì)胞富集中起積極作用。中性粒細(xì)胞簇的形成伴隨著ERK和p38 MAPK的磷酸化水平顯著增加，以響應(yīng)具核梭桿菌感染。這表明觀察到的ERK和p38 MAPK在患者腫瘤內(nèi)細(xì)菌定植微生態(tài)位中磷酸化的上調(diào)部分是由對腫瘤內(nèi)細(xì)菌的骨髓反應(yīng)驅(qū)動的。作者還觀察到感染了具核梭桿菌的CRC上皮細(xì)胞會遷移到周圍的膠原凝膠中。為了識別相關(guān)的信號通路改變，分離含有具核梭桿菌的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)暴露于具核梭桿菌導(dǎo)致了參與癌癥進(jìn)展的信號通路的顯著上調(diào)，與細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)等相關(guān)的信號通路下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，源自人類CRC的具核梭桿菌能在細(xì)菌感染部位積極誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞的招募，并促進(jìn)CRC上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化，從而促進(jìn)對周圍環(huán)境的入侵。
總結(jié)討論
從歷史上看，腫瘤異質(zhì)性僅歸因于克隆擴(kuò)增過程中癌細(xì)胞的內(nèi)在遺傳改變，之前有研究也揭示了來自TME的外在因素在腫瘤發(fā)生中起重要作用。已知癌細(xì)胞與其他非惡性細(xì)胞群（如TME中的成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞）之間的細(xì)胞間相互作用通過隨著癌癥的發(fā)展促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化來促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性。隨著我們對TME的理解不斷加深，我們對影響腫瘤異質(zhì)性的因素的理解也在提高?；诨蚪M學(xué)的研究表明，大多數(shù)主要類型的人類癌癥都含有腫瘤內(nèi)微生物群，這些微生物群落因癌癥類型而異，特定的細(xì)菌可促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展，影響患者對治療的反應(yīng)，從而影響生存。然而，存在的內(nèi)在異質(zhì)性使得難以理解TME不同組成部分之間的相互作用，包括天然組織背景下的細(xì)菌-宿主相互作用?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)和scRNA-seq技術(shù)的發(fā)展使得TME的真核成分得以研究，但迄今為止，TME中腫瘤內(nèi)微生物群的作用一直被忽視。在這項(xiàng)研究中，通過調(diào)整和應(yīng)用這些技術(shù)，作者得出結(jié)論，腫瘤內(nèi)微生物群在人類腫瘤中異質(zhì)分布。此外，作者發(fā)現(xiàn)它是TME的基本組成部分，可以改變不同細(xì)胞的生物學(xué)過程，影響抗腫瘤免疫和癌癥上皮細(xì)胞的遷移。通過激活JUN和FOS家族的轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌可以產(chǎn)生與癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞休眠一致的基因標(biāo)記。同樣，侵襲細(xì)菌負(fù)責(zé)招募髓系細(xì)胞以通過JAK-STAT信號誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過將特定的白細(xì)胞介素和趨化因子分泌到周圍環(huán)境中來促進(jìn)T細(xì)胞排斥和腫瘤生長。雖然本文關(guān)注的是胃腸道極端的兩種癌癥類型，但描述的工具和技術(shù)可以應(yīng)用于分析迄今為止已被證明含有腫瘤內(nèi)微生物群的33種主要癌癥類型?？偟膩碚f，腫瘤內(nèi)微生物群在患者腫瘤內(nèi)的分布不是隨機(jī)的，而是微生物群在具有支持癌癥進(jìn)展的免疫和上皮細(xì)胞功能的微生態(tài)位中高度組織。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05435-0
