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導讀：
抗PD-1免疫檢查點抑制劑(ICI)是目前治療復發(fā)/轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma ，HNSCC）的一線藥物。然而，其總體應答率可能低至20%，在PD-L1表達升高和腫瘤浸潤性T細胞的腫瘤中，應答率會增加。雖然這在一定程度上是T細胞依賴的機制，但在腫瘤微環(huán)境(TME)中可能有額外的細胞亞群介導對ICI的反應。近期研究表明，癌癥相關成纖維細胞(CAF)與這種耐藥性有關，但在人類TME中，但它們在免疫調(diào)節(jié)中的作用仍不清楚。本文利用單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析4例接受了αpd-1治療HNSCC患者。從scRNA-seq隊列中獲得的Head and Neck CAF(HNCAF)蛋白活性圖譜用來對28例患者的bulk轉(zhuǎn)錄圖譜的parental cohort進行蛋白質(zhì)活性富集分析。最后，采用體外共培養(yǎng)實驗驗證HNCAF亞型的功能。作者的研究結果表明不同的HNCAF亞群在人HNSCC的免疫調(diào)節(jié)環(huán)境中具有重要的功能1。
結果解讀：
作者使用scRNA-seq分析nivolumab治療前后的腫瘤細胞，seurat的基因表達聚類顯示了12個不同的細胞群。為了獲得更高的細胞亞群特征的分辨率，作者在ARACNe算法的基礎上用每個簇的scRNA-seq圖譜來推斷亞群特有的基因調(diào)控網(wǎng)絡，然后用VIPER進行蛋白質(zhì)活性分析?；诘鞍踪|(zhì)活性的重新聚類發(fā)現(xiàn)了另外兩個先前未被檢測到的簇，總共14個不同的細胞簇，這兩個簇在4名患者中表達一致(圖1A)。作者用熱圖可視化這些細胞群體之間的差異，并顯示出每個簇中最具差異的五種蛋白質(zhì)(圖1B)。作者首先評估了這些由VIPER產(chǎn)生的簇對治療的改變做出反應的能力。正如預期的那樣，基因表達和蛋白質(zhì)活性分析都顯示，nivolumab治療后T細胞和IFNγ蛋白活性增加(圖1C)。進一步研究其他細胞群體豐度的變化時，VIPER聚類法和基因表達聚類法均能顯示成纖維細胞之間的異質(zhì)性，并且有兩個簇(第4和第9簇)在治療后細胞比例顯著增加(圖1C)。利用SingleR的細胞譜系推斷，確定這兩個簇為成纖維細胞，表明頭頸癌中PD-1靶向免疫治療與CAF上調(diào)有關(圖1D)。此外，另外兩個簇(簇6和簇7)也被SingleR描述為成纖維細胞(圖1D)，但是在在免疫治療后沒有表現(xiàn)出顯著的差異，這表明在HNSCC TME中存在功能不同的CAF亞群。
為了進一步評估HNSCC的TME中不同CAF亞群之間的功能差異，作者使用ARACNe和VIPER對成纖維細胞進行了基于蛋白質(zhì)活性的亞群聚類。最終確定了五個不同的CAF簇，初步命名為HNCAF-0至HNCAF-4 (圖2a)。但是，基于基因表達的成纖維細胞亞群僅確定了兩個不同的CAF群體。在蛋白質(zhì)活性聚類鑒定的五個HNCAF群體中，HNCAF-0和HNCAF-3的細胞比例增加，HNCAF-1和HNCAF-2的細胞比例減少，而HNCAF-4的細胞比例不受影響(圖2B)。在五個簇中，前10個最具差異活性的蛋白質(zhì)，作者以不同活性轉(zhuǎn)錄因子和信號分子的排序列表的形式，突出了它們潛在的功能特性(圖2C)，以更好的理解每種HNCAF表型的分子生物學。為了評估每個HNCAF亞群與αPD-1免疫治療的臨床反應的相關性，作者使用HNCAF分子特征來分析28名患者parental cohort的Bulk RNA-se譜（對nivolumab反應）。αPD-1免疫治療后，在治療前患者中（有反應），HNCAF-0和HNCAF-3標記基因在統(tǒng)計學上顯著豐富(圖2D)。這一結果表明，在接受nivolumab治療后，HNCAF-0和HNCAF-3亞群也會擴大，提示這可能是預測人類HNSCC臨床療效的指標。相反，HNCAF-1、HNCAF-2和HNCAF-4細胞在治療后沒有擴張，它們的標志物在有反應者和無反應者中沒有明顯富集。
作者使用流式細胞術對手術標本中CAF的浸潤度進行了量化。CAF豐度，按照CD45- EpCAM- CD31- 定義的話，占活細胞總數(shù)的12%至58% (圖3A)。根據(jù)CD29和FAP的表達（流式），以前在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了不同的CAF亞群，稱為CAF-S1、CAF-S2、CAF-S3和CAF-S4。Kieffer團隊表明，在HNSCC中可以發(fā)現(xiàn)CAF-S1，但在HNSCC中是否存在其他CAF-S群體仍不清楚。然后，作者證實了乳腺癌中四個CAF-S亞群在HNSCC中的存在(圖3B)。CAF-S1和CAF-S2的豐度最高，而CAF-S3和CAF-S4的豐度非常低(圖3C)。
作者還檢測了之前定義的iCAF和myCAF基因集標記的一致性，這是在胰腺癌中首次描述的。Cell-by-cell富集分析顯示在HNCAF-1細胞中ICAF特征富集和在HNCAF-2細胞中MyCAF特征富集。作者在圖3D總結出HNCAF與乳腺癌或胰腺癌CAF表型之間的相關性。雖然HNCAF-0和HNCAF-3與CAF-S1細胞有一些相似之處，但作者認為HNCAF-0和HNCAF-3代表了新的成纖維細胞亞群，這些可能是頭頸癌所特有的，并可以預測患者的預后(圖2D)，這與ICAF/myCAF的分類并不完全匹配?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)顯示，VIPER分析對HNCAF的分類具有更高分辨率，更關鍵的是，通過VIPER識別的HNCAF群體與HNSCC的預后有顯著的相關性。
在沒有免疫治療的環(huán)境中，作者為了評估CAF群體的預后相關性，量化了TCGA HNSCC隊列中HNCAF蛋白活性特征的富集程度(圖4)。結果顯示，在TCGA患者中，HNCAF-0信號顯著富集，總存活率較高(圖4A)，這表明這些細胞不僅是免疫治療反應的重要調(diào)節(jié)因素，而且可能在HNSCC的臨床相關的內(nèi)源性免疫反應方面發(fā)揮關鍵作用。相反，當有足夠數(shù)量的患者時，HNCAF-1蛋白活性特征與早期總體生存率較差有關(圖4B)。HNSCC的預后與TCGA隊列中較高的TIL水平有關，這些結果與VIPER來源的HNCAF細胞的不同免疫調(diào)節(jié)功能作用一致。
作者研究了HNCAF-0和HNCAF-3細胞與其他TME亞群的潛在相互作用。相互作用組分析表明，HNCAF與CD8 T細胞的受體-配體相互作用比HNCAF與TME中的任何其他細胞亞型都要多。作者首次使用αSMA, αCD8, 和αcytokeratin抗體分析了HNSCC組織中CAF的整體浸潤模式。多重免疫熒光圖像顯示CAF與CD8+T細胞共同定位于間質(zhì)(圖5A，白色箭頭)。另外，當HNCAF-0/3細胞與T細胞（來自正常人的PBMC）共同培養(yǎng)時，HNCAF-0/3細胞降低了外源性激活的CD8 T細胞中PD-1+ TIM-3+的耗竭表型，增加了CD103+NKG2A+的組織駐留記憶T細胞表型(Trm)，以及它們的細胞溶解功能（由于穿孔素和顆粒酶B的表達）(圖5B)。Transwell共培養(yǎng)分析表明，上述現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于細胞之間的接觸導致(圖5C)。此外，HNCAF-0/3細胞與腫瘤浸潤性T細胞（直接從人HNSCC標本中分離）的共同培養(yǎng)可導致CD8 T細胞的Trm表型和細胞毒作用增加，但HNCAF-0/3細胞不能挽救終末耗盡型腫瘤浸潤性T細胞的耗盡表型(圖5D)。總之，HNCAF-0/3細胞強烈促進腫瘤浸潤性T細胞中活化標志物、穿孔素、顆粒酶B和IFNγ的產(chǎn)生(圖5D和E)。在培養(yǎng)的過程中，跟CD103+細胞一樣，作者發(fā)現(xiàn)HNCAF-0/3完全拯救了TGFβ介導的PD-1/TIM-3的表型，而不抑制總的TGFβ信號 (圖5F)。
為了評估CAF對每個HNCAF群體的T細胞耗竭的影響（在沒有有效抗體的情況下），作者利用DSP的數(shù)據(jù)來評估HNCAF-0和HNCAF-1蛋白活性信號在T細胞功能衰竭信號富集的區(qū)域的共定位。HNCAF-0的特征與TME感興趣區(qū)域的T細胞耗盡特征沒有顯著關聯(lián)(圖5G和H)。然而，盡管反復實驗，與HNCAF-1共培養(yǎng)的T細胞迅速死亡，留下活細胞的數(shù)量不足以用于進一步分析(圖5I)。單獨培養(yǎng)T細胞或與HNCAF-0/3細胞共培養(yǎng)均未觀察到T細胞死亡，提示HNCAF-1在體外介導了加速的T細胞凋亡。
為了測試這些HNCAF亞群的潛在能力，作者接下來根據(jù)腫瘤類型對TCGA中的HNCAF蛋白活性特征進行了富集分析，重點關注了具有高間質(zhì)細胞含量的腫瘤。富集分析表明，HNCAF-0的富集是HNSCC特有的，而HNCAF-1的富集更為普遍。有趣的是，HNCAF-1的升高在胰腺癌中最顯著，眾所周知，胰腺癌對基于PD-1的免疫治療沒有反應。HNCAF-1的表型與先前定義的胰腺癌ICAF亞群相匹配(圖3D)。
為了從外部驗證HNCAF-0/3在臨床反應預測方面的潛力，作者在另一組接受αpd-1免疫治療的HNSCC患者中測試了蛋白質(zhì)活性特征的富集分析。分析顯示，在患者（對pembrolizumab有反應）的治療前樣本中，HNCAF-0和HNCAF-3標志基因在統(tǒng)計學上顯著富集，作者在一個獨立的隊列中證實了HNCAF-0/3與免疫治療反應的關聯(lián)(圖6A)。雖然沒有HNCAF-0和HNCAF-3那么顯著，但對這一隊列的分析也顯示，HNCAF-2顯著富集(圖6A)。HNCAF-3，與無反應患者相比，有反應患者的總體富集度最強(圖6A)，AUROC下的預測區(qū)域也最高，AUROC為0.8(圖6B)，與文獻報道的PD-L1腫瘤比例評分(AUROC=0.66)和PD-L1聯(lián)合陽性評分相比有改善。
全文總結：
在這項研究中，作者使用VIPER算法分析蛋白質(zhì)活性譜識別出五種分子上不同的CAF亞型。另外，作者利用新輔助臨床試驗中生物樣本來表明，兩個亞型，HNCAF-0和HNCAF-3，可以預測出PD-1檢查點阻斷治療的良好反應。此外，作者還發(fā)現(xiàn)HNCAF-0/3細胞對CD8 T細胞具有免疫刺激作用，而HNCAF-1細胞與免疫抑制有關。作者的發(fā)現(xiàn)證明了不同的HNCAF亞群在調(diào)節(jié)人HNSCC的免疫調(diào)節(jié)環(huán)境中的重要性。
參考文獻：
1. Obradovic A, Graves D, Korrer M, et al. Immunostimulatory cancer-associated fibroblast subpopulations can predict immunotherapy response in head and neck cancer. Clin Cancer Res Mar 9 2022.
