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隨著單細胞轉錄組（scRNAseq）測序成本的降低和分析流程的優(yōu)化，scRNAseq在各類研究中的出鏡頻率越來越高。在pubmed中以“single cell RNA sequencing”為關鍵詞進行檢索，發(fā)現(xiàn)高達2.6萬條記錄（其中IF > 20的文章約1400篇），僅2022年就已發(fā)表1800多篇相關文章。scRNAseq普及之前，絕大多數(shù)實驗室只能依賴TCGA bulk RNAseq進行泛癌分析，而如今海量的scRNAseq數(shù)據(jù)為更高精度的泛癌分析提供了數(shù)據(jù)基礎，bulk+scRNAseq泛癌分析已成為切實可行的新思路。本篇推文中，編者選取最新發(fā)表在遺傳學Top期刊《Genome Medicine》雜志上的一篇泛癌基因標簽（gene signature）分析，對主要結果進行解讀，并結合兩篇同類型的文章進行總結，以供讀者參考。
背景
免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint inhibitor，ICI）療法開啟了腫瘤治療的新紀元。然而，只有少量病人對治療有反應，表明仍需挖掘新的biomarkers用于病人的精準分群，進而輔助治療方案的選擇。傳統(tǒng)的biomarker研究多基于完整腫瘤組織的bulk RNAseq，很難精準區(qū)分腫瘤內部的細胞亞群，對ICI治療的指示價值有限。而scRNAseq的高分辨率特性恰好可以彌補這一缺陷，可更加精準地表征腫瘤細胞的異質性，從而開發(fā)表征性能更好的biomarkers。
腫瘤干細胞（Cancer stem cells，CSCs）是一類具有自我更新能力的的癌細胞，可以促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移。多項研究證實腫瘤細胞干性（stemness）與腫瘤免疫逃避及治療抵抗密切相關。一項基于21種實體瘤的泛癌研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞干性與免疫細胞排斥相關，但其與臨床ICI結果之間的負相關關系尚無直接證據(jù)。利用CytoTRACE包，作者可以預測scRNA-seq數(shù)據(jù)種每個細胞的分化狀態(tài)，量化其stemness，進而鑒定與stemness密切相關的基因。
文中，作者首先在兩個ICI scRNAseq數(shù)據(jù)中證實干性和ICI效果之間的負相關關系；隨后基于34個scRNAseq數(shù)據(jù)集（17種腫瘤類型，345個病人，66萬個細胞）構建干性特征標簽（Stem.Sig），并在TCGA（>1萬個病人，30種腫瘤類型）、CRISPR數(shù)據(jù)集（4種腫瘤類型）和10個獨立的ICI數(shù)據(jù)集種進行了驗證；比較發(fā)現(xiàn)Stem.Sig能比以往報道的signatures更好地預測病人對ICI治療的反應。
結果一 腫瘤細胞干性與ICI抗性相關
基于兩個ICI scRNAseq數(shù)據(jù)集（SKCM，BCC），作者利用CytoTRACE量化了每個細胞的干性，結合治療結果發(fā)現(xiàn) non-respond（NR）患者中的腫瘤細胞干性更強。
結果二 基于泛癌scRNAseq數(shù)據(jù)構建Stem.Sig
作者收集了34個scRNAseq數(shù)據(jù)集用以構建Stem.Sig。Stem.Sig候選基因的條件為：1）在腫瘤細胞中顯著上調（logFC ≥ 0.25且FDR < 1e-5）；2）與CytoTRACE scores顯著正相關（Spearman R > 0 and FDR < 1e?05）；3）在34個數(shù)據(jù)集中的相關性（R）幾何平均數(shù)大于0.4。功能富集發(fā)現(xiàn)Stem.Sig中的基因顯著參與hypoxia、glycolysis、 ubiquitination、EPH-ephrin signaling、WNT Signaling及nucleotide excision repair等通路，這些通路均與腫瘤干細胞的干性維持和抗性密切相關（詳見討論部分）。且一些已報道的與ICI治療不良預后相關的基因如EPHA3、EPHA7、ENO1及ACTG1等也包含在Stem.Sig當中。
結果三 基于TCGA泛癌轉錄組數(shù)據(jù)分析Stem.Sig與免疫抑制之間的潛在聯(lián)系
為了解析Stem.Sig與免疫特征之間的關系，作者分別從代表性基因、通路和標簽（signature）等多個方面，探究它們與Stem.Sig之間的聯(lián)系。首先，作者鑒定了Stem.Sig與75個免疫相關基因之間在泛癌水平的負相關關系，并發(fā)現(xiàn)它與細胞毒性免疫細胞的浸潤水平也呈負相關，暗示了Stem.Sig與抗癌免疫之間的負調控關系。隨后，作者發(fā)現(xiàn)代謝通路、DNA repair和MYC signaling等與低水平免疫應答相關的通路，在Stem.Sig高的腫瘤中顯著富集。此外，對于一些知名的免疫抑制相關特征如腫瘤內異質性（Intra-tumoral heterogenicity， ITH），作者發(fā)現(xiàn)其與Stem.Sig顯著正相關。而對于腫瘤突變負荷（Tumor mutation burden， TMB），它也與Stem.Sig顯著正相關。與之似乎沖突的是，高水平的TMB通常與免疫應答相關。為此，作者將病人分為四組：high Stem.Sig/high TMB （HSHT）、high Stem.Sig/low TMB （HSLT）、low Stem.Sig / high TMB（LSHT）和low Stem.Sig / low TMB （LSLT）。通過比較不同組間免疫浸潤水平發(fā)現(xiàn)，抗癌免疫水平由高到低依次為：LSHT > LSLT > HSHT > HSLT，表明Stem.Sig水平低的腫瘤有更好的免疫水平。
結果四 利用Stem.Sig預測免疫治療效果
為了評估Stem.Sig對免疫治療的預測水平，作者收集了三類免疫治療（anti-PD(L)-1、anti-CTLA-4、anti-PD(L)-1和anti-CTLA-4聯(lián)合）共10個bulk RNAseq數(shù)據(jù)，以及相應的臨床信息。隨后，作者從7中機器學習算法中，挑選AUC值最高的Na?ve Bayes模型用于后續(xù)預測。在訓練集、驗證集和測試集三類數(shù)據(jù)中，均表明Stem.Sig是一個風險因子，高水平的Stem.Sig與病人不良預后顯著相關。最后，作者比較了Stem.Sig與已報道的泛癌signatures的預測水平，發(fā)現(xiàn)Stem.Sig表現(xiàn)普遍優(yōu)于已報道的泛癌signatures（更高的AUC值）。
結果五 基于CRISPR數(shù)據(jù)挖掘Stem.Sig中的潛在治療靶點
作者收集了7個免疫應答相關的CRISPR數(shù)據(jù)集用于該部分分析。對數(shù)據(jù)集包含的22505個基因根據(jù)z-score進行排序，Top-ranked的為免疫抵抗相關基因，在敲除后會促進抗腫瘤免疫反應；Bottom-ranked的為免疫敏感基因，敲除后會抑制抗腫瘤免疫反應。隨后，作者統(tǒng)計了Top-ranked與Stem.Sig以及其他泛癌signatures中基因的交集情況，發(fā)現(xiàn)Top-ranked基因與Stem.Sig有顯著交集，且比率顯著高于其他幾個signatures。該結果一方面挖掘了作為交集的潛在治療靶點，另一方面再次印證Stem.Sig的預測能力要優(yōu)于其他幾個signatures。
小結
該篇文章遵循“提出假說—建立模型—驗證模型”的思路，框架和結果清晰簡潔。作者從兩個scRNAseq數(shù)據(jù)集入手，初步建立腫瘤細胞干性和ICI治療抵抗之間的聯(lián)系，隨后基于大規(guī)模泛癌scRNAseq數(shù)據(jù)建立干性標簽Stem.Sig，并在TCGA泛癌數(shù)據(jù)中驗證Stem.Sig和多種免疫指標之間的關系。為了檢測Stem.Sig對ICI治療效果的預測能力，作者從7種不同的機器學習模型中挑選最優(yōu)模型，發(fā)現(xiàn)Stem.Sig能有效預測ICI病人預后，且效果優(yōu)于已報道的一些signatures。最后，作者還整合CRISPR數(shù)據(jù)，進一步精細定位到少數(shù)可作為潛在治療靶點的基因。
仔細閱讀這篇文章可有以下幾點收獲：1）對于分析為主的老師/學生，對數(shù)據(jù)一定要有敏感性，比如文章中提到的ICI數(shù)據(jù)集、scRNAseq數(shù)據(jù)以及CRISPR數(shù)據(jù)，要及時整理收藏做好記錄，不能等哪天需要了再去檢索；2）同理，文中提到了大量的signatures，比如各種泛癌signatures、免疫相關標志物/通路，也包括Stem.Sig本身，以后但凡涉及到解析不同組間免疫差異或分子機制，都可以活學活用，從多角度提供數(shù)據(jù)來支持自己的假說；3）由scRNAseq出發(fā)，結合TCGA泛癌數(shù)據(jù)進行挖掘，一方面提高了內容的精準度，為文章增色，另一方面也是充分利用公共數(shù)據(jù)，多角度證實假說的可行途徑。
現(xiàn)在scRNAseq課題的門檻和數(shù)年之前相比已經大幅度降低，提供了bulk RNAseq整合scRNAseq進行分析的數(shù)據(jù)基礎，因此對于分析為主的課題，都可以將scRNAseq數(shù)據(jù)考慮進去，提升課題質量。在“生信人”微信公眾號以往推文中，曾多次介紹過scRNAseq泛癌分析的相關內容， 現(xiàn)結合其中兩篇推文的內容，一并概括。兩篇推文中的文獻IF略高于6（cells，6.6；Cancers，6.1），均屬于純生信分析。
在第一篇文章（Single-Cell Transcriptomics Reveals the Expression of Agingand Senescence-Associated Genes in Distinct Cancer Cell Populations）中，作者收集了5類腫瘤的TCGA/GEO bulk RNAseq和scRNAseq數(shù)據(jù)。首先，基于TCGA/GEO數(shù)據(jù)鑒定與年齡和衰老相關的候選基因，并發(fā)現(xiàn)這些基因與在腫瘤中上調的基因之間有明顯交集?？紤]到bulk RNAseq數(shù)據(jù)中非腫瘤細胞的影響，作者收集了相應的scRNAseq數(shù)據(jù)，并在腫瘤細胞亞群中利用擬時分析，揭示了年齡和衰老相關基因在不同腫瘤細胞亞型中的表達特征。文章結構很簡單，在前兩個結果中鑒定出候選基因之后，后續(xù)結果就是簡單在5類腫瘤中重復多次分析，也沒有涉及更多角度的內容。此外，由于涉及的腫瘤類型很少，因此嚴格來講并不能算是泛癌分析。
第二篇文章（Cancer-Specific Immune Prognostic Signature in Solid Tumors and Its Relation to Immune Checkpoint Therapies）中，作者首先對5個不同類型腫瘤的scRNAseq數(shù)據(jù)進行分析，基于公開報道的免疫相關標志物（LM22、LM7、ImSig signature和NanoString）對細胞進行聚類分析，結果發(fā)現(xiàn)不同癌種的細胞均可分為2-3類免疫亞群，證實了腫瘤中主要免疫亞群的分群可靠性。隨后，作者基于同樣的標志物，對TCGA 20種腫瘤進行免疫分群，得到兩個不同的亞群，不同亞群之間有顯著的預后差異，但呈現(xiàn)出癌種特異性。為了構建預測模型，作者分別在每一類腫瘤中利用彈性網絡模型進行構建，最終得到155個與腫瘤預后相關的基因，基于這些基因進一步構建的Immune Score與病人預后顯著相關，但同樣呈現(xiàn)腫瘤特異性。此外，作者還結合ICI數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Immune Score可指示ICI治療后病人的應答狀況。該篇文章中，僅有第一部分涉及到scRNAseq內容，目的也僅僅是為了驗證免疫分群的猜想，因此盡管涉及癌種較多，但并算不上bulk RNAseq和scRNAseq“整合分析”。
綜上，大家在設計自己課題時，首先要做好數(shù)據(jù)調研，準備充實的數(shù)據(jù)基礎；其次，真正做到整合分析，而不是僅僅停留在使用了兩類數(shù)據(jù)；最后的重中之重，就是結合多方位的數(shù)據(jù)，講好自己的生物學故事。
