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肺癌腦轉移為最常見的顱內轉移瘤，目前肺癌腦轉移的起源及驅動因素仍不清楚。因此小編今天給大家分享一篇1月發(fā)表在Neuro-Oncology（IF:13.029）雜志上使用單細胞公共數據研究肺腺癌腦轉移風險的生信文章。文章使用差異基因表達，功能富集，拷貝數推斷及偽時序分析等方法對肺腺癌腦轉移的微環(huán)境、臨床結局、轉移風險及潛在藥物進行了全面分析，感興趣的小伙伴不要錯過呀。
Single-cell transcriptomic analyses provide insights into the cellular origins and drivers of brain metastasis from lung adenocarcinoma
單細胞轉錄組解析肺腺癌腦轉移的細胞起源和驅動因素
一． 研究背景
腦轉移(BM)是最常見的顱內惡性腫瘤，大約30%的實體腫瘤都會導致顱內轉移，其中肺癌腦轉移的發(fā)病率最高。此外，肺癌腦轉移患者的預后非常差，治療選擇也有限，且肺腺癌(LUAD)腦轉移的細胞起源和驅動因素尚未明確。因此，識別早期BM高?；颊哂葹橹匾?/span>。
二． 文章摘要
研究對11例肺腺癌原發(fā)腫瘤(PT)和10例BM樣本的單細胞轉錄數據進行了分析。研究首先探索了患者的細胞組成，并應用拷貝數變異(CNV)和克隆性分析來揭示BM腫瘤的細胞起源。此外，研究也通過偽時序分析識別腦轉移相關上皮細胞(BMAECs)。接著研究基于機器學習建立了預測組織RNA-seq數據中BMAECs相對豐度的BM指數，并分析了BM指數的預后價值。最后研究根據腫瘤細胞系藥物敏感性數據對靶向BMAECs的藥物進行了預測。
三． 文章的主要內容及結果
1. LUAD PT和BM樣本的單細胞轉錄組分析揭示細胞組成和免疫微環(huán)境差異
研究首先對LUAD PT和BM樣本的腫瘤微環(huán)境進行了分析。研究的總體工作流程如圖1A所示，在對scRNA-seq數據進行質控后，研究將PT和BM樣本的細胞劃分為23個亞群并進行了注釋(圖1B和C)，結果發(fā)現免疫細胞在PT和BM樣本中比例均較高，而轉移性上皮細胞(ECs)及T細胞和巨噬細胞則在BM中比例更高(圖1D和E)。研究也觀察到LUAD原發(fā)和轉移樣本的細胞構成完全不同(圖1F)。
接下來研究對免疫細胞和神經膠質細胞進行了重聚類。研究將7083個巨噬細胞劃分為10個不同的亞群，這些亞群被劃分為4個亞型(圖2A和B)，其中M1型巨噬細胞在PT和BM樣本中均最多，而免疫抑制型M2型巨噬細胞在BM中占比更高(圖2C)。接著研究通過GSVA發(fā)現來自BM的巨噬細胞富集到缺氧、P53信號和DNA修復等通路，而來自PT的巨噬細胞中干擾素γ反應、炎癥反應和TGF-β信號通路被激活(圖2D)。此外，19736個T細胞被重聚類成17個亞群，并被注釋為9個亞型(圖2E和F)，結果觀察到CD4+ T細胞在PT和BM樣本中均占比較高(圖2G)。GSVA分析發(fā)現KRAS信號通路在BM的T細胞中被激活，而G2/M檢查點和TGF-β信號通路在PT的T細胞中被激活(圖2H)。
2. CNV和克隆分析揭示BM腫瘤的細胞來源
這一部分研究進行了CNV和克隆分析來探索BM腫瘤的細胞起源。研究利用inferCNV推斷了PT(圖3A)和BM(圖3B)樣本ECs的CNV和克隆性。PT樣本中有1517個CNV評分高的內皮細胞被認為是惡性的，819個評分低的被認為是非惡性的(圖3C)。考慮到腦組織中沒有固有的ECs，因此來自BM樣本的全部ECs都被認為是惡性的，BM中CNV評分低的細胞非常少(圖3D)。接下來研究利用進化系統發(fā)生樹展示腫瘤克隆性和惡性腫瘤細胞的進化(圖3E)，結果在所有BM惡性細胞中均觀察到染色體7p和7q擴增(圖3F),此外位于7號染色體上的36個基因的拷貝數擴增也被PT中有7p或7q擴增的6個亞克隆細胞亞群共享(圖3G)。研究還發(fā)現位于PT 7號染色體上的100個基因的拷貝數擴增也存在于BM 7p或7q擴增的亞克隆中(圖3H)。研究也發(fā)現當LUAD轉移到腦時，7號染色體上35個基因的拷貝數擴增保持不變，BM樣本額外產生65個基因擴增(圖3I)。為了進一步評估PT和BM樣本的瘤內異質性，研究基于惡性細胞轉錄組學特征來計算每個樣本的多樣性評分，結果發(fā)現PT的多樣性評分顯著高于BM(圖3J)，而PT中惡性細胞的比例顯著低于BM (圖3 k)。GSVA也發(fā)現MYC靶點、PI3K/Akt/mTOR信號通路、上皮-間充質轉化(EMT)和細胞代謝相關通路在BM的惡性細胞中顯著激活(圖3L)。
3. 偽時序軌跡識別與BM相關的特定EC亞群
這一部分研究通過偽時序分析識別了與BM相關的EC亞群。研究將來自PT和BM樣本的7064個惡性ECs(圖4A)分為11個亞群，并命名為EC0-10(圖4B)。接著對這些細胞進行偽時序分析，結果觀察到來自PT和BM的ECs基本上遵循相似的分化軌跡，并參與了7種細胞狀態(tài)的轉換過程(圖4C)。在這些細胞亞群中，只有EC2由來自PT和BM樣本的細胞組成。因此，研究進一步對EC2進行了偽時序分析，得到了由細胞命運決定的三個細胞狀態(tài)(圖4D；S1-3)，其中狀態(tài)S2主要富集于BM細胞，狀態(tài)S3主要富集于PT細胞，狀態(tài)S1在PT和BM中均富集(圖4E)。GSVA發(fā)現在三種細胞狀態(tài)中分子通路的激活高度不同(圖4F)。隨后，研究進行了分支表達分析模型(BEAM)分析來確定這三種狀態(tài)下的分支依賴性基因，總共識別了45個基因，它們可以調節(jié)從狀態(tài)S1(前分支)到S2(細胞命運1)和S3(細胞命運2)的細胞分化過程(圖4G)。此外，由于EC2經歷了從祖細胞到兩種不同命運細胞的轉換，因此EC2細胞被定義為BMAECs。GSVA分析發(fā)現大多數癌癥相關通路在BMAECs中被激活(圖4H)。
4. 在PUMCH隊列中驗證BMAECs與轉移和預后關聯
這一部分研究對BMAECs與轉移及預后的關聯進行了分析。研究首先識別了ECs和EC2的標記基因，接著取交集作為BMAECs的標記基因。然后，將BMAECs的31個標記基因與跨細胞狀態(tài)的45個分支依賴基因取交集，并將交集的6個基因定義為BMAECs最具代表性的基因(圖5A)，并選擇S100A9作為BMAECs的標志物，結果研究使用標志物有效區(qū)分了PT和BM中的S100A9+EPCAM+惡性細胞和S100A9+炎性細胞(圖5B)。接著研究對30例LUAD PT樣本、37例BM樣本和33例NMPT樣本中的BMAEC(S100A9)和EC(EPCAM)標志物進行了共定位染色，結果在PT和BM樣本中觀察到S100A9和EPCAM共表達的BMAEC，不過PT和BM(圖5C)以及MBM和PBM樣本中BMAEC的比例無顯著差異(圖5D)。接下來研究通過ROC分析觀察到BMAEC比例在識別LUAD PT腦轉移和NMPT方面具有良好的性能(圖5E，F)。此外，生存分析顯示BMAEC比例高的LUAD患者MFS顯著較差(圖5 G)，而OS無顯著差異(圖5H)。
5. TCGA-LUAD隊列中BM指數與臨床病理特征的相關性
這一部分研究分析了BM指數與臨床病理特征的相關性。研究應用OCLR算法基于組織RNA-seq數據計算了499例TCGA LUAD患者的BM指數，以代表BMAECs的相對豐度(圖6A)。研究觀察到BM指數從TNMⅰ期到ⅳ期顯著升高，但T1期顯著低于T2-4期， N0期顯著低于N1-3期。接著單因素和多因素Cox回歸分析表明，BM指數是TCGA LUAD隊列中OS和DFS的獨立預后預測因素。K-M生存分析顯示，高BM指數患者的OS及DFS明顯較差(圖6B，C)。這代表BMAECs豐度越高，LUAD患者的TNM分期越高，預后越差。
6. 識別高BM指數患者及靶向BMAECs的治療藥物
在后一部分研究對抑制LUAD腦轉移的潛在治療藥物進行了預測。研究采用兩種不同的方法來確定抑制LUAD腦轉移的候選藥物，分別為靶向BMAECs和對高BM指數敏感的藥物(圖6D)。研究獲得了78個CTRP衍生的化合物和65個PRISM衍生的化合物用于靶向BMAECs，23個CTRP衍生的化合物和171個PRISM衍生的化合物用于高BM指數患者。通過取交集，最終確定2種CTRP衍生藥物和5種PRISM衍生藥物為治療腦轉移的候選藥物，其與BM指數呈負相關(圖6E)。其中拉帕替尼是抑制肺癌腦轉移的首選藥物，研究觀察到拉帕替尼的藥物靶點EGFR、ERBB2、RIPK2在BMAECs中高表達，并且與AUC呈負相關(圖6F)。同樣，ERBB3、PIK3C2B、EGFR和ERBB2在高BM指數患者中高表達，并且與AUC呈負相關(圖6G)。此外，該藥物的蛋白靶點EGFR、EGFR- pY1068也在高BM指數患者中高表達，且與AUC呈負相關(圖6H)。因此，EGFR被確定為拉帕替尼治療肺腺癌腦轉移的潛在靶點。
到這里這篇文章的主要內容就介紹完了。文章使用公共數據庫的單細胞轉錄組數據，通過研究PT及BM樣本的基因表達模式，富集功能，免疫微環(huán)境組成，上皮細胞分化軌跡等差異對肺腺癌腦轉移的細胞起源和驅動因素進行了詳細全面的分析。文章內容豐富，邏輯清晰，有理有據，用到的方法都比較經典，是一篇十分具有參考價值的單細胞生信分析文章。
