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大家好，今天給大家分享的是2022年5月發(fā)表在Hepatology（IF=17.2）上的文獻。非病毒性肝癌的關(guān)注率逐漸升高，其腫瘤免疫異質(zhì)性及其對聯(lián)合免疫治療反應(yīng)的影響尚未明確。本文通過多組學(xué)確定了肝癌瘤內(nèi)脂肪變性和耗竭腫瘤免疫微環(huán)境之間的聯(lián)系。
Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma
在肝細(xì)胞癌中多組學(xué)確定了瘤內(nèi)脂肪變性和耗竭腫瘤免疫微環(huán)境之間的聯(lián)系
研究背景：肝癌是全球致死率排名第四的癌癥。肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌類型，是一種具有多種病因的異質(zhì)性疾病。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是HCC的主要原因之一，由于監(jiān)測和治療不斷改善，全球HCV相關(guān)HCC（HCV-HCC）的患病率一直在下降。同時，非病毒性HCC的患病率正在迅速增加，其原因多種多樣，如酗酒、非酒精性脂肪肝（NAFLDA）和糖尿?。―M）。了解HCC的多樣性以開發(fā)靶向治療將需要解開致癌過程的分子機制。在過去20年中，已在遺傳和轉(zhuǎn)錄組水平上對HCC進行了分析。然而，分子和臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，特別是在非病毒性HCC患者中，尚未完全確定，除了最近關(guān)于NASH-HCC突變特征的一份報告。近年來，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在各種實體腫瘤中顯示出顯著療效。這些藥物包括針對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）、程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）及其配體PD-L1的單克隆抗體。2020年，IMbrave150試驗表明，與索拉非尼相比，使用阿替利珠單抗聯(lián)合貝伐單抗的抗PD-L1聯(lián)合抗VEGF療法顯著延長了不可切除HCC患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS），并且聯(lián)合免疫療法目前已成為治療HCC的焦點。雖然已成為晚期HCC患者的一線療法，但緩解率約為30%；因此，超過一半的患者不會獲得太多益處。這可能是由于HCC患者分子異常和腫瘤免疫微環(huán)境（Tumor Immune Microenvironment，TIME）的高度異質(zhì)性。一般來說，TIME根據(jù)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）水平和免疫檢查點表達分為免疫排除、免疫激活和免疫耗竭亞型。一項meta分析表明，TILs水平和PD-1/PD-L1表達與多種癌癥類型對ICIs的反應(yīng)呈正相關(guān)。然而，曾有人最近報道，盡管存在高水平的CD8+PD1+T細(xì)胞，但由于免疫監(jiān)測受損，非病毒性HCC，尤其是NASH-HCC對免疫治療的反應(yīng)可能較弱，提示NASH-HCC存在獨特TIME。然而，非病毒性肝癌的腫瘤免疫異質(zhì)性及其對聯(lián)合免疫治療反應(yīng)的影響尚未明確。在這項研究中，作者利用基因組和轉(zhuǎn)錄組對113名非病毒性HCC患者進行了分子和免疫學(xué)分析。這種多組學(xué)方法能夠根據(jù)預(yù)后或TIME對非病毒性HCC患者進行分層。作者進一步確定了脂肪變性HCC與免疫富集但免疫耗竭TIME之間的新聯(lián)系。從機制上講，作者發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞中的脂質(zhì)積累誘導(dǎo)PD-L1上調(diào)并促進共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的免疫抑制變化。最后，作者發(fā)現(xiàn)通過化學(xué)位移MR成像鑒定的脂肪變性HCC患者對使用抗PD-L1和抗VEGF抗體的聯(lián)合免疫治療敏感，這表明肝癌中腫瘤內(nèi)脂肪變性可能是預(yù)測免疫治療療效的新型成像生物標(biāo)志物。
數(shù)據(jù)：RNA-seq數(shù)據(jù)已保存在GEO中，登錄號：GSE190967。
基因組序列數(shù)據(jù)已保存在JGA中，登錄號：JGAS000523和JGAD000642。
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)已保存在JGA中，登錄號：JGAS000311。
結(jié)果：
1、多組學(xué)將非病毒性肝細(xì)胞癌分為三個預(yù)后亞型
通過腫瘤RNA測序了解非病毒肝細(xì)胞癌的分子異常。轉(zhuǎn)錄組學(xué)無監(jiān)督聚類分析將113例非病毒性HCC患者分為3類（I、II和III類）（圖1A）。I類患者預(yù)后最差，而III類患者預(yù)后最好（圖1B）。GAGE分析中I類顯示細(xì)胞周期和有絲分裂相關(guān)基因集隨著FOXM1和AURKB上調(diào)而富集，GAGE分析中III類顯示免疫細(xì)胞激活相關(guān)基因耗竭而wnt-β-catenin信號通路基因GLUL、SPARCL1、AXIN2、GREB1上調(diào)，樹突狀細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因CCL4、CCL5下調(diào)。結(jié)合之前分子分類研究，I類與Chiang分子分類中的增殖亞型關(guān)聯(lián)。II類與Chiang分類中的IFN亞型和Hoshida分類中的S1亞型相關(guān)聯(lián)。第III類與Chiang分類中CTNNB1亞型和Hoshida分類中的S3亞型相關(guān)聯(lián)（圖1A）。接下來，對55名非病毒性HCC患者進行基因組測序，檢測到69個基因異常，與前期研究一致。在55個樣本中有50個檢測到體細(xì)胞突變，并且經(jīng)常在TERT啟動子區(qū)、CTNNB1和TP53中觀察到（圖1C）。綜合分析顯示I類與TP53突變密切相關(guān)，III類與CTNNB1突變有關(guān)（圖1C）。TP53突變的非病毒性HCC預(yù)后最差，而CTNNB1突變的非病毒性HCC預(yù)后最好（圖1D）。
圖1 多組學(xué)將非病毒性肝細(xì)胞癌分為三個預(yù)后亞型。（A）非病毒性肝癌的轉(zhuǎn)錄組分型。（B）按分子分類的患者Kaplan-Meier分析。（C）55例非病毒性肝癌患者的基因組序列分析。（D）非病毒性肝癌患者基因組異常分層的Kaplan-Meier分析。
2、基于TIME的非病毒性HCC分類
接下來，為了根據(jù)TIME對非病毒性HCC進行分類，作者對腫瘤轉(zhuǎn)錄本進行了NTP分析，并確定了已報道的以瘤內(nèi)免疫浸潤性較強為特征的免疫細(xì)胞亞型。CIBERSORT分析發(fā)現(xiàn)113種腫瘤中有43種被歸類為免疫亞型，并顯示出更高水平瘤內(nèi)免疫細(xì)胞和CTLs（圖2A，B）。免疫亞型顯示腫瘤內(nèi)II類顯著富集，CTNNB1突變頻率明顯降低（圖2C，D）。CTNNB1突變的非病毒HCCs腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤水平顯著降低（圖2E）。
圖2 基于TIME的非病毒性HCC分類。（A）對腫瘤轉(zhuǎn)錄組NTP分析確定了113個腫瘤中的43個為非病毒性肝癌的免疫亞群。（B）免疫組和其他組之間總免疫細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的CIBERSORT評分比較。（C）免疫組和其他組各分子百分率比較。（D）免疫組與其他組CTNNB1或TP53突變百分率比較。（E）有CTNNB1突變與無CTNNB1突變的HCC之間CIBERSORT評分比較。
3、脂肪性HCC表現(xiàn)為免疫富集但免疫耗竭的免疫微環(huán)境
前期發(fā)現(xiàn)HCC中脂肪變性與免疫亞型密切相關(guān)，事實上脂肪性HCC占非病毒性HCC的23%（圖3A），它包含更高水平的瘤內(nèi)免疫細(xì)胞（圖3B，C）。有趣的是，ssGSEA和通路分析顯示，在脂肪變性HCC中，T細(xì)胞耗竭信號和基質(zhì)信號以及TGF-β激活水平顯著升高（圖3C，D）。脂肪變性HCC還顯示出多種與T細(xì)胞耗竭有關(guān)的免疫檢查點和轉(zhuǎn)錄因子以及癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）標(biāo)志物上調(diào)（圖3E）。此外，CIBERSORT分析顯示，脂肪變性HCC中有大量M2巨噬細(xì)胞浸潤，隨之參與巨噬細(xì)胞M2極化和免疫抑制的細(xì)胞因子和趨化因子也上調(diào)（圖3C，E）。免疫組化分析證實在GPC3+的HCC細(xì)胞中PD-L1表達上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)非病毒性肝癌標(biāo)本中CAFs和M2巨噬細(xì)胞大量浸潤（圖3G-J）。總的來說，脂肪性HCC呈現(xiàn)免疫富集但免疫耗竭的TIME，其特征是T細(xì)胞耗竭、M2巨噬細(xì)胞和CAFs浸潤、PD-L1高表達和TGF-β信號激活。
圖3 （A）脂肪性HCC的代表性圖像。T和NT分別代表腫瘤和非腫瘤。（B）脂肪變性和非脂肪變性HCC樣本的CIBERSORT總免疫細(xì)胞評分比較。（C）113例中26例被確定為脂肪性HCC。免疫得分圖顯示免疫相關(guān)基因富集得分和CIBERSORT得分熱圖。分子特征圖是顯示脂肪變性HCC中代表性基因相對表達水平熱圖。KEGG通路是顯示脂肪變性HCC中代表性信號通路富集熱圖。（D）脂肪性和非脂肪性HCC樣本間T細(xì)胞耗竭特征、基質(zhì)特征和TGF-β信號通路富集得分比較。（E）Heatmap顯示了抑制性免疫檢查點分子（上）、參與T細(xì)胞耗竭的轉(zhuǎn)錄因子（中）以及CAFs和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（下）的代表性基因表達水平。（F）脂肪變性和非脂肪變性HCC標(biāo)本中M2巨噬細(xì)胞CIBERSORT評分比較。（G）PD-L1、αSMA、CD163免疫組化圖像。（H-J）PD-L1陽性HCC標(biāo)本百分比（H）和脂肪性HCC與非脂肪性HCC的αSMA（I）和CD163（J）染色陽性區(qū)的比較。
4、耗竭T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和CAFs密切相互作用，構(gòu)成脂肪性HCC中的免疫耗竭微環(huán)境
為了進一步表征脂肪性HCC中免疫耗竭TIME，作者通過Visium平臺上的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢查了脂肪性HCC中M2巨噬細(xì)胞、CAF和CTLs的形貌。將腫瘤切片分為1768個點，從每個點獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。首先，基于圖形聚類將所有點分成6個簇，簇2免疫細(xì)胞群高表達（圖4A-C）。ssGSEA顯示簇2基質(zhì)信號和T細(xì)胞耗竭信號增強（圖4C）。作者提取了CD8A和NR4A1雙陽性斑點作為含有耗竭CTLs斑點，發(fā)現(xiàn)這些斑點幾乎有一半包含簇2（圖4D）。然后，作者比較了有或沒有耗竭CTLs位點之間的轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖4E），發(fā)現(xiàn)耗竭CTLs位點中M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163和CAF標(biāo)記物VIM表達增加，并且TGFB1水平升高（圖4F）。這些結(jié)果提示，M2巨噬細(xì)胞和CAFs可能產(chǎn)生TGF-β并促進周圍細(xì)胞耗竭，在脂肪變性HCC中形成免疫耗竭微環(huán)境。
圖4 耗竭T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和CAFs密切相互作用，構(gòu)成脂肪性HCC中的免疫耗盡微環(huán)境。（A）在Visium平臺上基于圖形的脂肪變性HCC組織空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聚類。（B）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聚類熱圖。基于圖的層次聚類分析將所有點分為6個聚類。（C）每個集群中免疫信號、基質(zhì)信號和T細(xì)胞耗竭信號的富集分?jǐn)?shù)。（D）餅狀圖顯示了每個集群中CD8A陽性和NR4A1陽性的耗盡CTL斑點百分比。（E）剖面圖上含有耗竭CTL斑點的位置。（F）小提琴圖顯示M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物、CAF標(biāo)志物和TGFB1在耗竭CTL斑點及其他部位的表達水平。
5、棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)積累可能促進脂肪變性HCC的免疫抑制
接下來，作者打算探究HCC中腫瘤內(nèi)脂肪變性與免疫耗竭TIME之間的機制聯(lián)系。因此，首先進行基于脂質(zhì)組學(xué)的總脂肪酸圖譜分析，發(fā)現(xiàn)脂肪HCC樣本中PA水平明顯高于非脂肪HCC組織。因此，作者在體外檢查PA積累對HCC細(xì)胞的影響。在Hep3B細(xì)胞中添加PA可誘導(dǎo)脂質(zhì)積累（圖5A），上調(diào)PD-L1表達（圖5B，C）以及上調(diào)CSF1、CXCL8和TGF-β1表達（圖5D，E），所有這些都可以促進M2巨噬細(xì)胞極化和/或激活CAFs。PA處理的Hep3B細(xì)胞能上調(diào)共培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞系CD206和IL10的表達（圖5F）和共培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞系TGFB1的表達（圖5G）。這些免疫抑制細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)也在脂肪變性HCC體內(nèi)觀察到（圖5H）。這些數(shù)據(jù)表明，PA在腫瘤細(xì)胞中積累促進免疫抑制，這可能有助于脂肪性HCC中免疫耗竭TIME的發(fā)展。
圖5 PA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)積累可能促進脂肪變性HCC的免疫抑制。（A）加入牛血清白蛋白（BSA）或棕櫚酸（PA）24小時后Hep3B細(xì)胞的染色圖像。（B）添加BSA或PA 24小時后Hep3B細(xì)胞中CD274 mRNA表達水平。（C）流式細(xì)胞術(shù)分析加入BSA或PA 24小時后Hep3B細(xì)胞中CD274蛋白表達水平（左）和平均熒光強度（右）。（D）加入BSA或PA 24小時后Hep3B細(xì)胞中CSF1、CXCL8和TGFB1的mRNA表達水平。（E）加入BSA或PA 24小時后Hep3B細(xì)胞上清中CSF1、CXCL8和TGF-β1蛋白分泌水平。（F）與添加了BSA或PA的Hep3B細(xì)胞共培養(yǎng)3天后，巨噬細(xì)胞中CD206和IL10 mRNA的表達水平。（G）與添加BSA或PA的Hep3B細(xì)胞共培養(yǎng)3天后，LX-2細(xì)胞中TGFB1 mRNA的表達水平。（H）脂肪變性和非脂肪變性HCC標(biāo)本中CD274、CSF1、CXCL8、TGFB1、CD206和IL10 mRNA的表達水平。
6、脂肪變性HCC患者對阿替利珠單抗聯(lián)合貝伐珠單抗聯(lián)合免疫治療敏感
作者回顧性分析了30名接受阿替利珠單抗聯(lián)合貝伐單抗治療的晚期HCC患者。根據(jù)化學(xué)位移MR，30名患者中有7名被歸類為脂肪性HCC（圖6A，B）。在5.4個月的觀察期間，脂肪性HCC患者均未出現(xiàn)疾病進展。因此，脂肪變性HCC患者PFS明顯長于非脂肪變性HCC患者。這些結(jié)果表明，脂肪變性HCC患者可能對ICI治療敏感，而腫瘤內(nèi)脂肪變性可能是預(yù)測ICI治療HCC療效的一種新的影像學(xué)生物標(biāo)志物。
圖6 脂肪變性HCC患者對阿替利珠單抗聯(lián)合貝伐珠單抗聯(lián)合免疫治療敏感。（A-B）脂肪性HCC代表性MR和HE圖像。（B）腫瘤活檢標(biāo)本HE圖像。（C）根據(jù)HCC中是否存在脂肪變性進行分層的患者無進展生存期Kaplan-Meier分析。
結(jié)論：
總之，多組學(xué)分析根據(jù)預(yù)后或TIME對非病毒性HCC進行分層。作者進一步確定了HCC瘤內(nèi)脂肪變性與免疫耗竭及免疫治療易感TIME之間的聯(lián)系。
參考文獻
Murai H, Kodama T, Maesaka K,et al. Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2022 May 14. doi: 10.1002/hep.32573. Epub ahead of print. PMID: 35567547.
