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大家好呀，今天分享的文章題為腹水液的單細(xì)胞測(cè)序顯示了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移期間的異質(zhì)性和治療誘導(dǎo)的進(jìn)化，于今年二月發(fā)表在Nature communication（IF: 17.694），本文通過在單細(xì)胞水平上分析不同組別的胃癌患者腹水液探索胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制，讓我們一起學(xué)習(xí)一下吧！
Single-cell sequencing of ascites fluid illustrates heterogeneity and therapy-induced evolution during gastric cancer peritoneal metastasis
一、背景
胃癌（Gastric cancer , GC）是全球第五大診斷癌癥和第四大癌癥的死亡原因。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移（gastric cancer peritoneal metastasis , GCPM）是治療性手術(shù)切除后常見的疾病，總生存期小于6個(gè)月。在手術(shù)期診斷為GCPM的胃癌患者從抗腫瘤治療策略中獲得的益處有限且GCPM發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不清晰。因此，深入、動(dòng)態(tài)地探索GCPM的發(fā)生和發(fā)展，有助于闡明GCPM的發(fā)病機(jī)制。本文通過分析不同GC單細(xì)胞數(shù)據(jù)探索GCPM的發(fā)病機(jī)制。
二、結(jié)果
1、胃癌患者的腹水或腹膜灌洗液中細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化
本文對(duì)35例患者進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，包括4例良性子宮肌瘤患者（正常陰性對(duì)照，G0組）正常腹腔灌洗液，4例早期胃癌患者(G1組）腹腔灌洗液；10例晚期胃癌患者(G2組）腹腔灌洗液；12例未治療診斷GCPM的晚期胃癌患者(G3組）腹水；5例全身治療后確診GCPM的晚期胃癌患者腹水(G4組）腹水（圖1a）。另外收集了4例未確診為GCPM的晚期胃癌患者的腹水樣本，培養(yǎng)腹水PDOs進(jìn)行基于抑制劑藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)和免疫熒光分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖1b）。對(duì)來自五組單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制、細(xì)胞過濾和去批次得到191987個(gè)細(xì)胞，鑒定出12個(gè)細(xì)胞簇（圖1c）?；趩渭?xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異的分析，結(jié)果顯示所有被鑒定出的上皮細(xì)胞均被證實(shí)為惡性腫瘤細(xì)胞。在GCPM進(jìn)展過程中， 12個(gè)細(xì)胞簇表現(xiàn)出不同的分布，巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞和T細(xì)胞是腹腔內(nèi)的主要細(xì)胞組成，分別呈減少和增加的趨勢(shì)（圖1d-e）。
2、單核細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞在GCPM期間表現(xiàn)出較高的多樣性和促血管生成表型
作者首先分析了G0-G3組，以探索GCPM過程中免疫細(xì)胞景觀和免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。髓系細(xì)胞主導(dǎo)著免疫細(xì)胞群，cDC2亞群在不同組間存在明顯差異，隨著胃癌的進(jìn)展，這些細(xì)胞浸潤(rùn)到腹腔內(nèi)的數(shù)量減少，特別是GCPM患者。為了探索細(xì)胞簇潛在獨(dú)特功能作用，作者又將髓系重新劃分為4個(gè)DC簇，3個(gè)巨噬細(xì)胞簇，2個(gè)單核細(xì)胞簇，1個(gè)中性粒細(xì)胞簇和1個(gè)肥大細(xì)胞簇（圖1f）。C3-DC是一個(gè)cDC2簇，具有較低的抗原-呈遞能力和較高的促血管生成能力，它似乎在很大程度上代表增殖的DC (圖1f-g)。
采用功能評(píng)分來探討GCPM過程中每種DC類型的功能變化，C1-DC和C4-DC簇在樹突狀細(xì)胞中抗原提呈能力最高，G3組抗原提呈能力無明顯變化，而C2-DC和C3-DC-簇（單核樣樹突狀細(xì)胞）在G3組抗原提呈功能評(píng)分和功能分子表達(dá)明顯降低。在G3組GCPM過程中，C2-DC和C3-DC簇顯示促血管生成功能評(píng)分和功能分子表達(dá)增加（圖2a-b）。對(duì)四個(gè)DC簇進(jìn)行擬時(shí)序分析，C1-DC和C4-DC簇位于起源，C2-DC簇位于中間，C3-DC簇抗原呈遞能力較低，在擬時(shí)序的末端，促血管生成能力較高（圖2c）。因此作者檢測(cè)了樹突狀細(xì)胞的代謝重編程，觀察到糖酵解和脂肪酸代謝沿單核細(xì)胞樣表型逐漸增加，而氧化磷酸化在早期和中期增加，在分化后期略有下降（圖2d）。擬時(shí)序熱圖發(fā)現(xiàn)C3-DC上調(diào)mTORC1激活和E2F信號(hào)通路相關(guān)基因，同時(shí)增強(qiáng)糖酵解、脂肪酸代謝、氧化磷酸化和膽固醇代謝；一些免疫檢查點(diǎn)基因沿DC分化軌跡逐漸上調(diào)，特別是在晚期，表明C3-CDC可能抑制腫瘤免疫（圖2e-f）。并驗(yàn)證了C3-DC簇基因特征與預(yù)后顯著相關(guān)，使其成為GCPM不良臨床結(jié)果的潛在指標(biāo)。
3、T細(xì)胞抑制狀態(tài)在GCPM進(jìn)展中有不同的重構(gòu)
T細(xì)胞在腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，本文又將T和NK細(xì)胞重新劃分（圖3a-b）。在腹膜生態(tài)系統(tǒng)中觀察到一個(gè)以MKI67、MCM2和PCNA高表達(dá)為特征的增殖循環(huán)T細(xì)胞簇（圖3a-c）。這些細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性和幼稚細(xì)胞基因的低表達(dá)，以及抑制標(biāo)志物的高表達(dá)（圖3d）。與G0-G2組相比，G3組的細(xì)胞毒性功能評(píng)分及相應(yīng)的標(biāo)記基因GZMA和GZMH均降低。因此，增殖循環(huán)T細(xì)胞簇可能表現(xiàn)出一種功能失調(diào)的狀態(tài)，并類似于一種幼稚的表型，GSEA分析表明，循環(huán)T細(xì)胞簇在參與細(xì)胞周期、糖酵解和DNA復(fù)制的基因中富集，可能準(zhǔn)備增殖所需的材料和能量，并在細(xì)胞毒性基因中負(fù)富集。
作者研究了增殖周期T細(xì)胞簇的組成，發(fā)現(xiàn)它由兩個(gè)CD8細(xì)胞簇（C1、C2循環(huán)T）和一個(gè)NKT細(xì)胞簇（C3循環(huán)T）的異質(zhì)細(xì)胞簇組成（圖3e）。與G1組和G2組相比，G3組的C2循環(huán)T細(xì)胞簇比例增加（圖3f）。通過分化循環(huán)T細(xì)胞軌跡，發(fā)現(xiàn)軌跡始于C6-CD8幼稚簇，通過C4-CD8和C1循環(huán)T細(xì)胞簇，最終形成C2循環(huán)T細(xì)胞簇（圖3g-h）。代謝轉(zhuǎn)變對(duì)于CD8 T細(xì)胞的存活、增殖、分化和抗腫瘤免疫中的激活至關(guān)重要。觀察到糖酵解、脂肪酸代謝和NAD代謝隨著發(fā)育軌跡的變化而明顯上調(diào)（圖3g，i），增殖型C2循環(huán)T細(xì)胞高表達(dá)增殖基因，獲得部分幼稚功能，導(dǎo)致細(xì)胞毒性功能降低，抑制功能增強(qiáng)（圖3h，j）。因此C2循環(huán)T細(xì)胞簇可能代表了一個(gè)耗盡和功能失調(diào)的階段。
4、治療誘導(dǎo)的單核細(xì)胞樣DC和循環(huán)T細(xì)胞免疫表型的進(jìn)化
腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)胞在治療前后表現(xiàn)出很強(qiáng)的異質(zhì)性，觀察到治療后C2-DC簇減少（圖4a），治療導(dǎo)致C3-DC細(xì)胞（早期顯示為GC的晚期群體）獲得增殖和促血管生成能力，其抗原的呈遞能力顯著降低（圖4b）。C3-DC細(xì)胞顯著上調(diào)炎癥因子CCL2、CCL3和CCL4，可能招募炎癥單核細(xì)胞、單核細(xì)胞樣、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入腹膜，導(dǎo)致促血管生成和免疫抑制生態(tài)系統(tǒng)。GSEA分析發(fā)現(xiàn)，G4組中的C3- DC細(xì)胞高表達(dá)了參與炎癥反應(yīng)、NF-kappa B信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和Notch信號(hào)通路的基因。相反，G3組中的C3-DC細(xì)胞高表達(dá)了參與抗原加工和呈遞、MHC-II受體活性和T輔助細(xì)胞分化的基因（圖4c）。
作者通過GSVA來評(píng)估G3組和G4組之間的單核細(xì)胞樣DC簇的代謝活性；G4組中C3-DC簇上調(diào)氧化磷酸化和糖酵解，并伴有透明質(zhì)酸代謝和嘌呤代謝；C2-DC簇顯示線粒體功能下降，其特征是氧化磷酸化和脂肪酸線粒體氧化下調(diào)，糖酵解和丙酮酸代謝增加（圖4d）。全身治療顯著降低了C3-CD4 Treg細(xì)胞的比例，在GCPM期間增加，抑制和幼稚功能降低，提示免疫抑制狀態(tài)改善（圖4e-f）。此外，功能評(píng)分分析顯示，循環(huán)T細(xì)胞在抗腫瘤治療下（G4組）表現(xiàn)出細(xì)胞毒性/增殖功能降低，而幼稚功能增加，提示循環(huán)T細(xì)胞功能可能會(huì)因治療壓力而沉默，這種轉(zhuǎn)變可能是對(duì)抗腫瘤藥物的自我保護(hù)機(jī)制。代謝分析表明，循環(huán)T細(xì)胞在治療過程中經(jīng)歷了明顯的代謝重編程，通過上調(diào)氧化磷酸化、檸檬酸循環(huán)和谷胱甘肽代謝，這可能與藥物代謝有關(guān)（圖4g）。
5、單核細(xì)胞樣DC和循環(huán)T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的進(jìn)化
癌癥免疫治療可以浸潤(rùn)到實(shí)體腫瘤中來重塑免疫細(xì)胞的表型，但其對(duì)腹膜的影響尚不清楚。作者通過比較免疫治療（2例患者）和化療（3例患者）的腹水樣本，探索免疫檢查點(diǎn)變化。與化療相比，免疫治療中C2-DC和C3-DC的比例降低（圖5a），在功能上，C2-DC簇下調(diào)了抗原呈遞能力，而促血管生成能力沒有顯著變化，C3-DC簇在免疫治療中同時(shí)下調(diào)了抗原呈遞能力和促血管生成能力（圖5b）。通過比較兩組之間的C2-DC DEGs，發(fā)現(xiàn)免疫治療組的C2-DC細(xì)胞低表達(dá)MHC分子相關(guān)的基因。值得注意的是，免疫治療后的C2-DC細(xì)胞對(duì)促炎表型呈負(fù)向富集，且抗炎相關(guān)基因高表達(dá)（圖5c）。同樣，C3-DC和C3-Macro簇在免疫治療下表現(xiàn)出抗炎表型，NF-kappa B通路和促炎表型的負(fù)向富集，表明單核細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和TAM樣巨噬細(xì)胞廣泛向抗炎表型轉(zhuǎn)移（圖5d）。為了研究免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)模式，CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2）是PD-1相關(guān)免疫檢查點(diǎn)的兩種配體，在單核細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和TAM樣巨噬細(xì)胞中很少表達(dá)。其他可以誘導(dǎo)T/NK細(xì)胞并隨后抑制其細(xì)胞毒性免疫檢查點(diǎn)如VSIR、MIF、LGALS9和SIGLEC10在C2-DC和C3-DC簇中表達(dá)，并且其在免疫治療（與化療相比）中增加（圖5e）。接下來，作者探討了在免疫治療過程中腹膜浸潤(rùn)性T細(xì)胞的免疫表型變化，與化療相比，免疫治療中C2-CD4 naive和C3-CD4 Treg簇比例降低，表明免疫治療可能減少免疫抑制T細(xì)胞簇（圖5f）。此外，免疫治療導(dǎo)致共刺激標(biāo)記基因CD27、CD69和TNFRSF14的表達(dá)增加。細(xì)胞功能分析表明，CD8 T細(xì)胞的百分比高細(xì)胞毒性功能略有增加，進(jìn)一步的功能評(píng)分分析顯示，免疫治療并沒有明顯增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但可以增加具有高細(xì)胞毒性功能的CD8 T細(xì)胞的百分比（圖5g）。然而，免疫治療顯著誘導(dǎo)了幾個(gè)免疫檢查點(diǎn)的上調(diào)。免疫治療組C3-CD4 Treg簇在免疫治療后優(yōu)先表達(dá)免疫檢查點(diǎn)基因CTLA4、TIGIT、CD47、CD96和TNFRSF1B，免疫治療后循環(huán)T細(xì)胞簇中VSIR、CD47、CD96和TNFRSF1B表達(dá)上調(diào)（圖5h）。
6、高可塑性GC通過一個(gè)保守的細(xì)胞程序演變?yōu)楦咴鲋承訥C
作者將所有上皮細(xì)胞分為7個(gè)簇，C1-3腫瘤簇幾乎被所有的GC病例所共享，而C4-7腫瘤簇僅在單個(gè)病例中存在（圖6a）。比較了C1-3簇的增殖、分化和可塑性等腫瘤特征，發(fā)現(xiàn)C1-腫瘤簇具有高度分化能力，C2-腫瘤簇具有高度可塑性，C3-腫瘤簇具有高度增殖能力（圖6b）。研究定義了一個(gè)上皮細(xì)胞可塑性程序，稱為paligenosis，分為特征不同的三個(gè)階段。paligenosis已被證明是分化細(xì)胞在癌前狀態(tài)如胃化生等狀態(tài)下回到祖細(xì)胞狀態(tài)的過程，本文推斷，GC主要源于化生病變，可能通過繼續(xù)使用paligenosis來維持治療的可塑性。c2-腫瘤簇具有高的自噬、高的可塑性和低的mTORC1活性，這是早期麻痹（1-2期）的特征。c3-腫瘤簇具有高的mTORC1活性和高增殖，是晚期paligenosis的特征。對(duì)C1-3腫瘤集群擬時(shí)序發(fā)現(xiàn)c1-腫瘤細(xì)胞增加了“分化”，減少“增殖”和“可塑性”表型。
GSEA分析發(fā)現(xiàn)治療后C2-腫瘤簇可塑性增強(qiáng)（G4組），表現(xiàn)為Hedgehog、ERBB通路激活和細(xì)胞極化重構(gòu)（圖6c）。軌跡分析發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)G3組的部分C2-腫瘤簇發(fā)展為G3組的C3-腫瘤簇，另一部分發(fā)展為G4組的高度可塑性的C2-腫瘤簇。在細(xì)胞軌跡的末端，G4組的C2-腫瘤細(xì)胞失去了一定的可塑性，獲得了增殖能力，發(fā)展為G4組的C3-腫瘤簇。整個(gè)發(fā)育軌跡是細(xì)胞可塑性的持續(xù)進(jìn)化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖（圖6d-f）。在C2-腫瘤-G4-Group簇富集的軌跡的中間，細(xì)胞具有上皮細(xì)胞的特征間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞軌跡的末端，C3-腫瘤-G4-Group簇富集，細(xì)胞以細(xì)胞周期進(jìn)入和Wnt通路激活為特征，表明G4組的C3-腫瘤細(xì)胞在獲得增殖能力的同時(shí)保持了相當(dāng)大的多能性（圖6f）。G4組的C2-腫瘤簇和C3-腫瘤簇均表現(xiàn)出代謝重編程和多藥耐藥性增加。G4組的C2-腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步表現(xiàn)為線粒體功能下降，糖酵解和糖原代謝增加（圖6g）。
7、自噬抑制阻斷胃癌PDOs的凋亡并誘導(dǎo)凋亡
為了研究GCPM過程中的細(xì)胞調(diào)控，對(duì)所有細(xì)胞簇進(jìn)行了細(xì)胞通訊的分析，令人驚訝的是，最強(qiáng)的細(xì)胞通訊是在C2和C3腫瘤細(xì)胞之間（圖7a）。為了解碼調(diào)控C2和C3腫瘤細(xì)胞的分子網(wǎng)絡(luò)，在TCGA STAD數(shù)據(jù)庫中尋找C2腫瘤細(xì)胞的DEGs、自噬相關(guān)基因和GC患者預(yù)后相關(guān)基因之間的交叉點(diǎn)，只有MARCKS和TXNIP存在于C2腫瘤細(xì)胞簇的所有三個(gè)基因集中（圖7b）；C3腫瘤細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)交叉基因（圖7c）。PDOs是針對(duì)癌癥患者的基因進(jìn)化研究、生物標(biāo)志物鑒定和藥物篩選的有效工具。對(duì)4例GCPM晚期胃癌患者的腹水樣本進(jìn)行PDOs分析，MARCKS和TXNIP蛋白的表達(dá)與晚期（3期）麻痹癥標(biāo)志物pS6和KI67的表達(dá)不相關(guān)，但它們與早期麻痹癥標(biāo)志物DDIT4、ATF3以及SOX9（由2期誘導(dǎo)）共表達(dá)（圖7d），作者用自噬或mTORC1抑制劑治療腹水，因?yàn)樽允烧T導(dǎo)和mTORC1激活分別是早期和晚期麻痹的標(biāo)志。自噬和mTORC1抑制劑均能顯著降低了腹水的生長(zhǎng)。與mTORC1抑制劑TORIN1和雷帕霉素相比，自噬抑制劑DC661和羥基氯喹對(duì)腹水生長(zhǎng)的抑制作用更有效（圖7e，f）。發(fā)現(xiàn)只有DC661或羥基氯喹誘導(dǎo)了類器官死亡，這表明自噬和mTORC1抑制劑通過不同的機(jī)制阻礙生長(zhǎng)（圖7e中紅色箭頭）。為了進(jìn)一步分析自噬和mTORC1抑制劑治療后的類器官死亡特征，用自噬或mTORC1抑制劑處理的PDOs對(duì)CC3（(cleaved caspase3）和KI67進(jìn)行染色。DC661和羥基氯喹顯著誘導(dǎo)腹水PDOs細(xì)胞凋亡，與未處理的對(duì)照組和mTORC1抑制劑處理的PDOs相比，CC3/KI67陽性細(xì)胞的比例增加，證實(shí)自噬抑制導(dǎo)致麻痹失敗，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖7g，h）。
三、小結(jié)
本文描述了35例胃癌腹膜轉(zhuǎn)移（GCPM）患者的腹水癌/免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。在GCPM進(jìn)展過程中，可見單核細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（DCs）的增加，這些細(xì)胞具有促血管生成作用，抗原呈遞能力降低，并與胃癌（GC）預(yù)后不良相關(guān)。作者還探究了治療后單核細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)性和增殖性T細(xì)胞的進(jìn)化，比較了免疫治療和化療前后細(xì)胞變化和功能改變，最后使用細(xì)胞通訊和PDOs進(jìn)行驗(yàn)證。本文通過對(duì)不同時(shí)期的GC樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，從而更加精準(zhǔn)的劃分細(xì)胞亞型，進(jìn)行不同細(xì)胞簇的差異對(duì)比，更加細(xì)致的刻畫了GCPM單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀。
參考文獻(xiàn)：Huang XZ, Pang MJ, Li JY, Chen HY, Sun JX, Song YX, Ni HJ, Ye SY, Bai S, Li TH, Wang XY, Lu JY, Yang JJ, Sun X, Mills JC, Miao ZF, Wang ZN. Single-cell sequencing of ascites fluid illustrates heterogeneity and therapy-induced evolution during gastric cancer peritoneal metastasis. Nat Commun. 2023 Feb 14;14(1):822. doi: 10.1038/s41467-023-36310-9 . PMID: 36788228; PMCID: PMC9929081.
