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哈嘍，各位同學大家好~好久不見，分外想念呢。今天想和大家分享的是一篇關(guān)于癌癥起源的文章（Cell Rep，9.4233）。癌癥很可怕，但比癌癥更可怕的是癌癥轉(zhuǎn)移，癌細胞擁有無限的生長能力，增殖能力和轉(zhuǎn)移能力。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，癌細胞就會侵入人體其他組織器官，導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡。此外，在癌癥轉(zhuǎn)移發(fā)生后，很多癌癥治療方法都會受到限制，治療難度大大提高。然而，現(xiàn)階段研究對“轉(zhuǎn)移細胞是如何產(chǎn)生的”這一問題尚不清楚。引起轉(zhuǎn)移的細胞必須首先在原發(fā)腫瘤內(nèi)獲得促轉(zhuǎn)移狀態(tài)，再參與遷移機制，并最終在其他地方形成繼發(fā)腫瘤塊。那么這種促轉(zhuǎn)移狀態(tài)以及轉(zhuǎn)移細胞又是如何產(chǎn)生的呢？就讓我們一起帶著這個問題開始今天的文獻學習之旅吧。
日內(nèi)瓦大學的科學家們通過尋找誘導(dǎo)最近表征的促轉(zhuǎn)移狀態(tài)，作為轉(zhuǎn)移起源的替代物，并進一步探究細胞死亡誘導(dǎo)療法是否會誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌細胞的促轉(zhuǎn)移狀態(tài)。最終發(fā)現(xiàn)一類獲得促轉(zhuǎn)移狀態(tài)的瀕死細胞（PAME），并發(fā)現(xiàn)其擁有在體內(nèi)形成遠端轉(zhuǎn)移的能力。這些PAME細胞表現(xiàn)出細胞因子風暴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和核重編程能力增強等特點。PAMEs誘導(dǎo)鄰近腫瘤細胞成為PAME誘導(dǎo)的遷移細胞(PIMs):其同樣擁有高度遷移能力，重現(xiàn)細胞因子風暴并增強PAME遷移（圖解摘要）。因此，研究者認為瀕死細胞可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移重編程和細胞因子風暴獲得促轉(zhuǎn)移能力。
圖解摘要
On the origin of metastases: Induction of pro-metastatic states after impending cell death via ER stress, reprogramming, and a cytokine storm
轉(zhuǎn)移的起源:通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、重編程和細胞因子風暴誘導(dǎo)細胞瀕臨死亡后的促轉(zhuǎn)移狀態(tài)
1.瀕死細胞活下來，就成了我：PAME
對異質(zhì)結(jié)腸癌CC14細胞進行細胞致死STS處理（激酶抑制劑十字孢堿觸發(fā)晚期凋亡細胞的存活），6 h后用凋亡抑制劑Q-VD-OPh + DIDS進行阻斷（圖1A-B）。僅用DMSO或BLOCK處理的細胞(對照組)不受影響(圖1B)，而用STS處理的細胞100%死亡并出現(xiàn)凋亡表型(圖1B-C)。STS + BLOCK處理 5天后部分PAMEs被挽救并出現(xiàn)增殖(圖1C)。PAMEs經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后均為lacZ+，并經(jīng)XGal染色鑒定(圖1D)。而單獨的BLOCK無效，PAMEs的遷移細胞數(shù)量增加12倍(圖1D)。在其他結(jié)腸癌CC36，Ls174T， DLD1等細胞株中均可觀察到相似現(xiàn)象(圖1E-F）。將CC14 PAME lacZ移植到裸鼠中(圖1H)，與DMSO/DMSO或?qū)φ?DMSO/BLOCK)組相比，肺遠端轉(zhuǎn)移瘤分別增加3.4倍和1.5倍(圖1H)，表明存在內(nèi)源性凋亡細胞的挽救現(xiàn)象。從CC14 PAME原發(fā)腫瘤中移植的細胞顯示出2倍的遷移能力(圖1I)，表明PAME后代在多次分裂后仍保持著較強的轉(zhuǎn)移能力。
圖1. PAMEs表現(xiàn)出穩(wěn)定、增強的遷移和轉(zhuǎn)移能力
2.凋亡阻斷劑相關(guān)的多種藥物誘導(dǎo)PAME
通過regorafenib和BLOCK處理4天后，細胞數(shù)量達到原來的30% - 40%。經(jīng)過2天的恢復(fù)和擴展后，PAMEs REG顯示出2.5倍的遷移能力(圖1G)。此外，用非apocalyptic STS處理，然后在不含BLOCK的環(huán)境培養(yǎng)7天后，細胞的遷移能力提高4倍，其他臨床相關(guān)化療藥物處理后，細胞遷移能力也表現(xiàn)出不同程度的增強(圖1J)。
3. PAMEs中分泌性、干性和轉(zhuǎn)移性重編程因子表達增強
研究者進一步對PAME-CC14（STS PAMEs）和對照細胞進行RNA-seq測序分析，在STS PAMEs中細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥/免疫反應(yīng)和細胞外基質(zhì)組織相關(guān)基因表達上調(diào)，有利于細胞因子風暴的形成。額外的qRT-PCR分析顯示SNAIL1、ZEB1和VIM在PAMEs中升高2倍或更多(圖2B)，提示在此過程中EMT能力增強。此外，所有被檢測的結(jié)腸癌PAMEs都具有高水平表達的干細胞標記物NANOG/NANOGP8(圖2B)，并且大多數(shù)也表達高水平的轉(zhuǎn)移性重編程因子OCT4、SOX2和KLF4 (圖2B)。
圖2. PAME轉(zhuǎn)錄組分析和PIM誘導(dǎo)
4. PAMEs誘導(dǎo)鄰近癌細胞成為高度遷移的PIMs
分別將RFP+CC14細胞與對照細胞和PAMEs共培養(yǎng)，相比對照組，與PAMEs共培養(yǎng)的細胞其遷移能力增加9倍(圖2C-D)。被PAMEs誘導(dǎo)獲得高度遷移能力的腫瘤細胞被稱為PIMs (PAMEs誘導(dǎo)遷移細胞)。PAMEs GFP和PIMs RFP的基因表達分析表明PAMEs中上調(diào)的重編程/干性特征在PIMs中缺失(圖2E)。然而，兩種細胞在顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的top基因中表現(xiàn)出明顯重疊(圖2E)。為測試PIM誘導(dǎo)擴散的可能性，研究者使用C11細胞進一步檢測PIM (PIMs1)誘導(dǎo)更多PIM (PIMs2)的能力。PAMEs誘導(dǎo)的PIMs1被FACS分離，其遷移能力增加26倍(圖3A-B)。此外，經(jīng)PIMs1誘導(dǎo)后生成的PIMs2同樣保持高度遷移能力，雖然這種能力稍低于PIMs1（圖3C-D）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)在遷移能力越強的細胞中，INSL4和IL32表達越高（圖3E-F）。PIM誘導(dǎo)在傳播過程中遷移能力逐漸下降。
5. PITS 分泌誘導(dǎo)PIM是一種常見現(xiàn)象
研究者預(yù)測PIM誘導(dǎo)會分泌細胞因子風暴(PITS)，因此進一步測試PAME培養(yǎng)基對PIM的誘導(dǎo)(圖3G)。在研究者發(fā)現(xiàn)來自不同細胞甚至多個細胞的PAMEs培養(yǎng)基(CM)誘導(dǎo)的PIMs相比對照CM處理的同類型細胞均發(fā)生不同程度的增加 (圖3H-J)。
圖3. PIM誘導(dǎo)和條件培養(yǎng)基
6. PIMs與PAMEs關(guān)聯(lián)并發(fā)生共同遷移
與對照組相比，將CC14 PIMs移植到裸鼠中并沒有增加其轉(zhuǎn)移能力(圖3K)。因此研究者推測PIMs可能會幫助PAMEs轉(zhuǎn)移。標記共培養(yǎng)物的延時照片分析顯示PAME-PIM細胞的關(guān)聯(lián)頻率是對照-對照細胞的10倍(圖4A和4B)。這種關(guān)聯(lián)很密切，在共焦顯微鏡中出現(xiàn)黃色重疊區(qū)(圖4C)。梭形細胞形態(tài)（通常與主動遷移有關(guān)）在20%的PAMEs中存在，但在對照細胞中非常少見(圖4C)。與PIMs-RFP相關(guān)的PAMEs-GFP表現(xiàn)出這種表型的頻率是單獨PAMEs的兩倍(圖4C)。對24小時后穿過過濾器的細胞進行染色，當超過95%的細胞為單一細胞時，顯示CC14 PAME-lacZ與PIM-AP混合后細胞比對照混合細胞增加2.5倍(圖4D)，并且這種趨勢可以保持4天。以上結(jié)果表明PAMEs-lacZ與PIM-AP的相關(guān)性比對照組lacZ、AP混合物增強4倍(圖4D-E)。此外，與PAMEs單獨培養(yǎng)或PAMEs- lacz與細胞分選后的PAMEs- GFP /AP共培養(yǎng)相比，PAMEs-PIMs共培養(yǎng)細胞的的遷移增加4倍(圖4F)。PIM培養(yǎng)基對PAME遷移沒有影響(圖4G)。當PAME與PIM共同存在時的轉(zhuǎn)移效率比PAME與PAME共同培養(yǎng)時提高1.8倍(圖4H)。
圖4. PAMEs/ PIM的關(guān)聯(lián)和遷移及常見細胞因子風暴的識別
7. PIM和PAME轉(zhuǎn)錄組的相似性
與對照組相比，PAMEs和PIM存在顯著交疊的差異表達基因，其中炎癥反應(yīng)、細胞因子活性、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)以及分泌因子相關(guān)基因在PAMEs和PIM中同時上調(diào)，并且存在頻繁的蛋白質(zhì)互作(圖4I-J)。此外，與對照組相比，12個細胞因子蛋白在CC14-PAME培養(yǎng)基中表達豐度增加2倍（圖4K），表明PITS 含有多種細胞因子和分泌因子。
8. PITS與CXCL8、MIF、EGFR、COX2、IL32和INSL4的活性相關(guān)
CXCL8在PAMEs和PIM中上調(diào)，在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)和細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究者在CC14細胞中加入CXCL8配體后，其遷移細胞數(shù)量增加(圖5A)。相比之下，CXCL1配體加入后遷移細胞數(shù)量下降 (圖5A)。為抑制內(nèi)源性CXCL8功能，研究者將一種CXCR1/CXCR2受體阻斷劑添加到培養(yǎng)皿中，預(yù)處理1小時后發(fā)現(xiàn)PAMEs誘導(dǎo)的PIM遷移量減少2倍(圖5B)。
AZD-5069是另一種CXCR2的拮抗劑，但AZD-5069處理后未觀察到遷移變化(圖5B)，表明CXCL8通過CXCR1發(fā)揮作用。由于0.1-1 ug/mL的CXCL8(圖5A)不能表現(xiàn)出PITS的強度(圖3G-H)，研究者進一步在PAMEs中測試其他上調(diào)因子的影響。ISO-1處理PAME誘導(dǎo)PIM后，PIM遷移率降低30%(圖5B)。在PAME中AREG上調(diào)后遷移能力增加(圖5A)，而用西妥昔單抗阻斷其受體EGFR的活性會導(dǎo)致PIM遷移的減少(圖5B)。
IL32和INSL在PAMEs和PIM中上調(diào)，參與遷移和侵襲調(diào)節(jié)過程。IL32誘導(dǎo)遷移能力增強(圖5A)。在CC14細胞中，通過cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)直接表達INSL4可使細胞的遷移行為增強2倍(圖5A)，這與CXCL8無關(guān)。與CXCL8不同，在藥理學上無法阻斷INSL4作用(圖5B)，而且由于其在PAMEs中的誘導(dǎo)作用非常高，因此難以充分抑制INSL4，這促使研究者構(gòu)建CRISPR-Cas9雙突變克隆，刪除其啟動子ATGs。在體外，INSL4和IL32突變體使遷移能力和遠端轉(zhuǎn)移能力顯著下降(圖5C)。
9. PAMEs和PIM顯示單細胞定義的促轉(zhuǎn)移狀態(tài)
研究者先前的scRNA-seq工作分析識別出一類METSP(促轉(zhuǎn)移細胞亞群，圖5D)，CXCL8、INSL4和IL32在METSP中高表達 (圖4J)。為進一步確定PAMEs和PIM是否表現(xiàn)出METSP促轉(zhuǎn)移狀態(tài)，研究者將在RNA-seq(也在scRNA-seq中檢測到)中常見的PAME/PIM上調(diào)和下調(diào)基因映射到四個先前定義的scRNA-seq簇(圖5D- E)。PAME/PIM上調(diào)基因主要在METSP中表達，而下調(diào)基因則映射到非METSP中 (圖5E)。在PAME/PIM中上調(diào)且顯著富集到METSP中的基因主要與浸潤，細胞因子活性等生物學過程相關(guān)(圖5F)。
圖5.PAMEs和PIMs與多功能細胞因子風暴相關(guān)，并表現(xiàn)出促轉(zhuǎn)移
10. PAMEs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
METSP細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因，如DDIT3(編碼CHOP)、HSPA5(編碼BIP)、ATF 等表達增強(圖6A)。一致地，研究者發(fā)現(xiàn)在PAME-CC14和PAME-C11中，發(fā)生剪接的XBP1、DDIT3和HSPA5的表達水平有所提高(圖6B)。鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系，研究者進一步測試高度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對驅(qū)動遷移能力的影響。經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)處理后的CC14和E3細胞中DDIT3和HSPA5表達升高，遷移能力降低(圖6C，藍條)。研究者進一步基于PERK抑制劑(PERKi;GSK2606414)測試內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路PERK-ATF4- CHOP對遷移的影響。PERKi處理增強其遷移能力，降低DDIT3和HSPA5表達(圖6C和6D)， PERKi和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)處理相互平衡(圖6C)。此外，遷移活躍的PAMEs-C11和PIM中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記物水平降低(圖6E)，這與遷移的CC14細胞中HSPA5下調(diào)一致，但其他METSP基因保持不變(圖6E)。PERKi阻斷PREK，進一步增強PAME-CC14和PAME-C11的細胞遷移(圖6F-G)。
圖6. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)PAME遷移能力
11. CHOP、NANOG和GLI參與PAMEs
CHOP是PERK的下游因子，研究者通過敲除DDIT3驗證其對遷移的影響。DDIT3敲除后PAME細胞的遷移能力顯著下降(圖7A)。然而，除NANOG/P8和GLI1沒有明顯表達增加外，DDIT3敲除PAME中的PAME特征仍然存在(圖7A)。因此，研究者推測CHOP對于轉(zhuǎn)移性PAMEs重編程是必要的。研究者進一步直接測試NANOG的作用，發(fā)現(xiàn)NANOG在癌細胞中是由轉(zhuǎn)移性重編程誘導(dǎo)以及增強轉(zhuǎn)移狀態(tài)所必需的，并與GLI1發(fā)揮協(xié)同作用。NANOG/NANOGP8敲除未觀察到GLI1和CXCL8的上調(diào)以及轉(zhuǎn)移能力的增強(圖7B)。
上述結(jié)果提示GLI基因可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和轉(zhuǎn)移性重編程/NANOG之間發(fā)揮關(guān)聯(lián)作用。因此，研究者進一步探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強是否可以激活GLI1。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)處理后GLI1表達升高(圖7C)。GLI1的表達導(dǎo)致NANOG/P8上調(diào)，IL32增強(圖7C)，GLI3影響IL32和CXCL8，抑制INSL4(圖7C)。因此，研究者認為主要是由GLI1，而不是GLI3負責調(diào)節(jié)PAME特征和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的反饋，以及DDIT3表達升高 (圖7C)。
以上結(jié)果表明在被攻擊后僥幸存活的人類結(jié)腸癌細胞，可以通過細胞重塑，誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移狀態(tài)。瀕死細胞可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移重編程和細胞因子風暴獲得促轉(zhuǎn)移能力。 (圖7D-E)。
圖7. 通過CHOP、NANOG和GLI參與的PAMEs誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移發(fā)生
據(jù)報道，除非腫瘤過大，壓迫到重要臟器以外，絕大部分癌癥病人并不是直接死于原發(fā)腫瘤。然而，癌細胞轉(zhuǎn)移會使腦，骨等重要器官收到侵害，數(shù)據(jù)顯示90%的患者死于癌癥轉(zhuǎn)移。所以癌細胞的轉(zhuǎn)移，對控制和治療腫瘤是至關(guān)重要的。在本篇文章中，研究者將誘導(dǎo)最近表征的促轉(zhuǎn)移狀態(tài)作為轉(zhuǎn)移起源的替代物。通過誘導(dǎo)瀕死細胞并測試其轉(zhuǎn)移、遷移能力，發(fā)現(xiàn)這些本應(yīng)死亡的細胞會自我重新編程，然后呈現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)移風險。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)細胞瀕死狀態(tài)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使PAME細胞得以發(fā)育以及細胞因子風暴產(chǎn)生。該研究為新的癌癥轉(zhuǎn)移治療策略鋪平道路，有利于防止某些由于治療產(chǎn)生的促轉(zhuǎn)移區(qū)域的發(fā)展。PAME細胞可能是未來潛在的治療和轉(zhuǎn)移預(yù)防靶點。
以上研究主要是基于實驗方法探索轉(zhuǎn)移起源，那么在我們生物信息學分析中，又該如何定義影響癌癥患者轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素呢？下面小編還想和大家分享一個探究人類癌癥轉(zhuǎn)移的數(shù)據(jù)庫：HCMDB。
腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因。在過去十年中，高通量技術(shù)已經(jīng)提供與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄組變化的全基因組概括。許多微陣列和RNA測序研究致力于尋找不同類型癌癥的轉(zhuǎn)移相關(guān)表達模式。然而，這些表達數(shù)據(jù)僅僅被分散存儲在各個數(shù)據(jù)庫中，缺乏一個集成的數(shù)據(jù)挖掘平臺，并對這些數(shù)據(jù)進行高效地分析挖掘。為便于對轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入分析，研究者對這些轉(zhuǎn)移相關(guān)的表達數(shù)據(jù)進行全面整合，并構(gòu)建出HCMDB(人類癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)庫，http://hcmdb.i-sanger.com/index)，在這里我們可以免費查詢跨平臺轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。
圖8. HCMDB數(shù)據(jù)庫
HCMDB的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主要來源于GEO、SRA、TCGA數(shù)據(jù)庫。在當前版本的HCMDB中，包含來自超過455個實驗的29種癌癥類型。為注釋這些潛在的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，研究者從7000多篇發(fā)表的文獻中收集2183個基因(1901個蛋白編碼基因，24個lncRNA和203個miRNAs)，構(gòu)建易于使用的癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因查詢和瀏覽界面。
表1. HCMDB的數(shù)據(jù)資源
該數(shù)據(jù)庫提供搜索功能，可以提供相關(guān)基因基本信息，以及在轉(zhuǎn)移樣本中的表達變化：
圖9.檢索功能
圖10.轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達分析
此外，研究者還可以對不同數(shù)據(jù)中在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移樣本中差異表達基因等進行檢索，并提供可視化結(jié)果。
圖11.差異表達基因及其可視化結(jié)果
當然，本文提供數(shù)據(jù)集合以及實驗支持基因轉(zhuǎn)移相關(guān)數(shù)據(jù)集下載。
圖12.數(shù)據(jù)下載
除轉(zhuǎn)錄組差異外，近期發(fā)表于CELL的一篇文章也對癌癥轉(zhuǎn)移的基因組特征進行探究，該工作主要基于整合大規(guī)模基因組和臨床數(shù)據(jù)，確定不同腫瘤類型轉(zhuǎn)移模式和基因組改變之間的關(guān)聯(lián)，為研究轉(zhuǎn)移擴散的生物學基礎(chǔ)提供寶貴的資源，并強調(diào)染色體不穩(wěn)定性在癌癥進展中的復(fù)雜作用，在這里我們就不重點介紹了，感興趣的小伙伴們一定要自己去看哦。
圖13. 癌癥轉(zhuǎn)移的基因組特征
癌細胞固然極其“可恨”，但是它頑強的意志品質(zhì)卻值得我們每個人學習。希望我們都能像“癌細胞”一樣頑強，哪怕是只有一線生機，也絕不放棄任何前進的希望。今天的分享到這里就結(jié)束啦，我們下次再見~
參考文獻：
1.On the origin of metastases: Induction of pro-metastatic states after impending cell death via ER stress, reprogramming, and a cytokine storm
2. HCMDB: the human cancer metastasis database
3. Genomic characterization of metastatic patterns from prospective clinical sequencing of 25,000 patients
