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腫瘤殺傷作用機(jī)制主要通過被抗原激活后的T細(xì)胞釋放顆粒酶和穿孔素，對T細(xì)胞的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)存在很多不同功能狀態(tài)的T細(xì)胞，其對免疫反應(yīng)可能起到促進(jìn)或抑制作用。今天給大家分享一篇發(fā)表在Nature Reviews Cancer（IF：69.8）雜志上的綜述性文章，這篇文章詳細(xì)描述了腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞中不同類別細(xì)胞在分化、毒性、自我更新能力、增值能力等方面的特性，免疫組化、流式、質(zhì)譜、單細(xì)胞等多項(xiàng)技術(shù)都可用于T細(xì)胞功能研究，而當(dāng)下流行的scTCRseq技術(shù)，使得可以追蹤不同T細(xì)胞在腫瘤進(jìn)化過程中的動(dòng)態(tài)變化。本文全面揭示了抗腫瘤T細(xì)胞免疫相關(guān)因素，可用于指導(dǎo)基于T細(xì)胞的各種免疫療法的臨床治療。下面讓我們正式開始吧~
研究背景
T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的主力軍，是免疫治療異質(zhì)性研究關(guān)鍵點(diǎn)之一。隨著單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)患者進(jìn)行如免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼性細(xì)胞療法、癌癥疫苗等免疫治療方案時(shí)，研究腫瘤免疫微環(huán)境中T細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，特別是腫瘤特異性反應(yīng)T細(xì)胞亞群特征成為可能。
T細(xì)胞免疫反應(yīng)是通過TCR來完成，當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，通過TCR與MHC呈遞抗原復(fù)合物相互作用，產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細(xì)胞，能夠穿越組織并消除目標(biāo)抗原，以及產(chǎn)生記憶細(xì)胞，它們可以在抗原再次攻擊的情況下持續(xù)存在并提供長期保護(hù)。每個(gè)T細(xì)胞表面具有獨(dú)一無二的TCR分子，對TCR的克隆性研究可以跟蹤在癌癥免疫治療干預(yù)過程中抗腫瘤性T細(xì)胞分化軌跡、克隆進(jìn)化以及表型變化。
研究結(jié)論
本綜述詳細(xì)闡述腫瘤特異性反應(yīng)T細(xì)胞中不同類別在分化程度、細(xì)胞毒性、自我更新能力、抗原負(fù)荷、增殖能力、人體分布位置等方面的差異，TCR序列分析進(jìn)一步揭示TME中不同T細(xì)胞狀態(tài)與T細(xì)胞克隆性增殖相關(guān)性，追蹤T細(xì)胞克隆動(dòng)態(tài)和腫瘤進(jìn)化過程。結(jié)合單細(xì)胞技術(shù)研究進(jìn)展揭示癌癥免疫治療反應(yīng)性T細(xì)胞特征，闡明與產(chǎn)生抗腫瘤T細(xì)胞免疫相關(guān)的因素，未來可用于指導(dǎo)設(shè)計(jì)更有效的治療策略。
研究成果
TIL
在原生態(tài)的腫瘤微環(huán)境中，免疫T細(xì)胞可以浸潤到腫瘤組織內(nèi)部，也可以識別部分抗原表位，但無法完全消除腫瘤細(xì)胞。一方面可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞有限的免疫原性，而小鼠慢性抗原刺激模型和熱腫瘤中TIL特征研究結(jié)果顯示，抗腫瘤T細(xì)胞在癌癥進(jìn)展過程中逐漸出現(xiàn)功能障礙，從而引發(fā)免疫逃逸，恢復(fù)腫瘤免疫微環(huán)境中TILs的功能成為現(xiàn)在免疫治療的重點(diǎn)。
目前scRNA數(shù)據(jù)主要通過去卷積方法從混合轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中對T細(xì)胞進(jìn)行亞群分類，由于T細(xì)胞廣泛的功能狀態(tài)、特異性TCR的數(shù)量龐大、T細(xì)胞反應(yīng)在時(shí)間和組織間隔上是動(dòng)態(tài)的，需要進(jìn)行縱向樣本收集，增大了分析難度。而把scRNA、scTCR-seq等單細(xì)胞技術(shù)和下面列舉的多種其它免疫研究方法結(jié)合，可以提高T細(xì)胞亞群分析能力和準(zhǔn)確性。
1）免疫組化技術(shù)直接對CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而將腫瘤分為免疫學(xué)上的熱腫瘤或冷腫瘤；通過有限的細(xì)胞標(biāo)志物，多重免疫組化和免疫熒光可以獲得特性細(xì)胞群體的細(xì)胞狀態(tài)信息，同時(shí)保留定量和位置信息。
2）多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)可以對腫瘤組織解離后的單細(xì)胞懸浮液，利用有限細(xì)胞標(biāo)志物，體外分離成不同T細(xì)胞亞群（<30），使得體外研究T細(xì)胞免疫反應(yīng)性增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生成為可能。
3）金屬同位素（>40）標(biāo)記抗體對單細(xì)胞染色，結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，對特定單細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行檢測。
4）scRNAseq對不同T細(xì)胞亞群表型特征進(jìn)行研究，推測分化軌跡，scTCR-seq分析TCR克隆性，進(jìn)一步確定T細(xì)胞的殺傷能力。隨著抗原特異性篩選工具的出現(xiàn)，提供了關(guān)于可以結(jié)合TCR的表位的信息，從而刺激T細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
圖1. CD8+T細(xì)胞不同分化亞群
腫瘤免疫浸潤T細(xì)胞（TIL）是影響癌癥患者預(yù)后的重要因素，包括腫瘤內(nèi)、腫瘤邊緣T細(xì)胞檢測以及腫瘤內(nèi)T細(xì)胞毒性檢測。不同癌癥類型微環(huán)境中存在不同細(xì)胞狀態(tài)的T細(xì)胞，這里的不同指的是細(xì)胞分化程度、細(xì)胞毒性、增殖能力和干細(xì)胞潛能的不同?！盁帷蹦[瘤通常富集CD4+T和CD8+T細(xì)胞，這類T細(xì)胞來源于前體T細(xì)胞被抗原刺激后激活和分化產(chǎn)生。
TCR克隆性
腫瘤免疫微環(huán)境中CD4+和CD8+ T細(xì)胞具有不同的表型，而腫瘤免疫作用取決于它們通過TCR參與接收的主要信號，在胸腺發(fā)育過程中V（D）J重組形成的TCR獨(dú)特的分子條形碼，可以用來檢測和跟蹤T細(xì)胞在不同時(shí)間段和身體部位的克隆動(dòng)態(tài)。TME中的主要克隆通常被用作腫瘤抗原局部識別的間接證據(jù)，當(dāng)對基于離散免疫標(biāo)記分離的TILs細(xì)胞亞群進(jìn)行TCR測序，可以更詳細(xì)地了解特定T細(xì)胞狀態(tài)與TME內(nèi)克隆擴(kuò)增相關(guān)性以及推斷TME內(nèi)T細(xì)胞克隆進(jìn)化情況。有研究發(fā)現(xiàn)，大部分TILs克隆具有非重疊的PD1+或PD1-分布，這表明單個(gè)T細(xì)胞克隆傾向于優(yōu)先獲得耗竭或非耗竭表型，克隆擴(kuò)增CD8+TIL優(yōu)先顯示耗竭表型。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析加上 scTCR-seq（檢測到配對的TCRα鏈和β鏈信息），為TME內(nèi)克隆型動(dòng)力學(xué)的表征提供了前所未有的分辨率。最近對黑色素瘤的TILs進(jìn)行TCR測序分析發(fā)現(xiàn)，Tex具有較低的TCR多樣性，與高腫瘤內(nèi)克隆擴(kuò)張一致，而Tex細(xì)胞的TCR克隆可以在Tpe和Tte中追蹤到，提示這些不同細(xì)胞狀態(tài)存在一個(gè)連續(xù)體?？寺U(kuò)增的TCR也可以在Tmem細(xì)胞內(nèi)觀察到，但它們與Tex細(xì)胞的TCR是不同的且不重疊，表明抗原特異性在塑造T細(xì)胞表型屬性中起著關(guān)鍵作用。
除了TME中T細(xì)胞克隆性的測量外，其他研究還試圖基于不同解剖位置的對比分析來推斷抗腫瘤特異性T細(xì)胞克隆分布模式。一項(xiàng)對RCC TME的研究報(bào)告稱，腫瘤組織TCR多樣性比正常組織低（即克隆擴(kuò)展的TIL更多），與腫瘤抗原識別驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞擴(kuò)張的概念一致，寡克隆與獲得耗竭的表型有關(guān)，并隨著疾病分期的加深而逐漸增加。多項(xiàng)實(shí)體瘤研究發(fā)現(xiàn)，TME中Tex細(xì)胞中擴(kuò)增的CD8+TCR克隆型在外周血中很少檢測到，平均占循環(huán)T細(xì)胞庫的0.1%，而在腫瘤內(nèi)Tmem細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的克隆型很容易在外周檢測到，占循環(huán)T細(xì)胞的10%-15%。
定義腫瘤特異性反應(yīng)T細(xì)胞
腫瘤特異性反應(yīng)T細(xì)胞即T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原具有反應(yīng)性，TCR主克隆對應(yīng)細(xì)胞群通常代表具有局部抗原反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，但有研究表明大部分克隆擴(kuò)增TILs并不具備抗腫瘤活性。一項(xiàng)大型肺癌和結(jié)直腸癌研究發(fā)現(xiàn)，具有非耗竭表型的CD8+ TILs能夠識別廣泛的病毒表位（EBV、CMV和流感等），但由于缺乏激活或衰竭標(biāo)記以及無法識別腫瘤抗原，這種存在于TME中的Tmem細(xì)胞被歸類為“旁觀者”。病毒特異性淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)先記憶表型這一事實(shí)并不令人驚訝，因?yàn)橛洃浖?xì)胞通常是在抗原負(fù)荷被清除后急性感染后產(chǎn)生的?！罢嬲摹笨鼓[瘤TIL的特征需要區(qū)別于旁觀者，即證明T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原的反應(yīng)性。
腫瘤抗原包括兩大類，腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）和腫瘤特異性抗原（TSAs），前者在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都有表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)模式是異常的，后者只在腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)。
TILs去卷積還有一大難點(diǎn)是無法確定對自體腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性的TCR，而通過在體外將表達(dá)TCR序列細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)測定具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)腫瘤細(xì)胞在體外繁殖能力差。對于黑色素瘤患者來說，建立自體來源的細(xì)胞系是最可行的。有研究證明，在黑色素瘤中表達(dá)抑制性受體的CD8+TIL，如PD1、LAG3和TIM3（即Tex細(xì)胞），在體外純化和攻擊自體腫瘤細(xì)胞時(shí)，顯示出最高水平的激活（即CD137表面上調(diào)）、效應(yīng)細(xì)胞因子（如干擾素γ）的分泌和靶向溶解。其他一些研究雖然沒有直接評估腫瘤反應(yīng)性，但通過多肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）多次染色證實(shí)了腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的耗竭表型。
病毒特異性旁觀者T細(xì)胞是如何被招募到腫瘤免疫微環(huán)境中的，可能通過如下幾種方式：
1）具有Tmem表型的細(xì)胞能夠通過表達(dá)不同的歸巢（CD62L和CCR7）和遷移受體（細(xì)胞間粘附分子1（ICAM1）和血管粘附分子1（VCAM1））在次級淋巴器官和外周組織之間循環(huán)；
2）大多數(shù)腫瘤同時(shí)表現(xiàn)為高血管化和炎癥（盡管程度取決于不同的腫瘤類型），可能導(dǎo)致T細(xì)胞吸引和定植；
3）病毒特異性T細(xì)胞在循環(huán)中以高頻率被檢測到，這增加了它們在TME內(nèi)再循環(huán)的可能性。
不管導(dǎo)致病毒特異性T細(xì)胞歸巢進(jìn)入TME的機(jī)制是什么，我們不能排除，一旦進(jìn)入TME，它們可能潛在地參與抗腫瘤活性，這是最近提出的由炎癥線索觸發(fā)的間接和TCR獨(dú)立激活。
抗腫瘤活性TILs
scTCR-seq可以得到T細(xì)胞配對的TCRα鏈和β鏈信息，通過體外合成瘤內(nèi)TCR導(dǎo)入報(bào)告細(xì)胞，和自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，通過測定抗原特異性激活來篩選治療性T細(xì)胞。TILs的擴(kuò)增數(shù)量并不等同于抗腫瘤反應(yīng)性，這很大程度上取決于腫瘤類型。一項(xiàng)黑色素瘤研究發(fā)現(xiàn)，TME內(nèi)的抗腫瘤T細(xì)胞存在于從Tpe、Tte和Trm-like Tex表達(dá)狀態(tài)分化的連續(xù)體中。與之形成鮮明對比的是，Tmem TILs占腫瘤特異性區(qū)室的比例不到2%。進(jìn)一步的研究將scTCR-seq和全轉(zhuǎn)錄組分析與體外篩選TCR對有限腫瘤抗原的特異性結(jié)合起來（圖2），以評估TME內(nèi)抗腫瘤特異性的廣度。這一系列深入的研究一致表明，實(shí)體腫瘤中的腫瘤特異性T細(xì)胞幾乎完全存在于Tex細(xì)胞中，腫瘤表達(dá)抗原的特異性，而不是抗原類別本身（TAA or TSA），驅(qū)動(dòng)TME內(nèi)的T細(xì)胞耗竭。腫瘤反應(yīng)性TILs的特征現(xiàn)在越來越多地用于腫瘤活檢中推測的腫瘤反應(yīng)性TILs的預(yù)測，如檢測TILs中PD1和CD39的表達(dá)以量化可能對腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞；評估腫瘤反應(yīng)性CXCL13+ Tex TILs水平已越來越多地被用作許多具有高腫瘤突變負(fù)擔(dān)的實(shí)體腫瘤的預(yù)測指標(biāo)，因?yàn)樗c免疫治療后預(yù)后的改善有關(guān)。
圖2. 具有抗腫瘤活性TCR配體鑒定方法列表
相對較少的研究關(guān)注在CD4+T細(xì)胞上，但圖2中單細(xì)胞測序和TIL反應(yīng)性篩選的廣泛研究表明它們對TIL中的私有新抗原和TAA具有特異性。有個(gè)疑問是，CD4+T細(xì)胞是否能識別腫瘤細(xì)胞，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面缺乏HLA II類表達(dá)。黑色素瘤體外測量TCR對自體腫瘤的反應(yīng)性揭示了CD4+ TILs與癌細(xì)胞之間不同的相互作用模式，CD4+ T細(xì)胞可以通過APC激活，也可以直接識別腫瘤細(xì)胞殺傷，映射為TME中的PD1+ CXCL13+ Tex細(xì)胞簇，并顯示細(xì)胞毒性（表達(dá)IFNγ和顆粒酶A）。在同時(shí)具備TME炎癥的情況下比較明顯的，CD4+ T細(xì)胞在HLA II類表達(dá)異常的黑色素瘤亞群中的直接激活。雖然腫瘤特異性Treg細(xì)胞TCRs可以被癌細(xì)胞刺激，目前尚不清楚腫瘤細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)具有免疫抑制功能的CD4+ TILs，或者更有可能是通過抗原模仿作用于已有的Treg細(xì)胞。未來的研究將需要評估腫瘤特異性Treg細(xì)胞如何在TME內(nèi)外分化。
基于T細(xì)胞的免疫療法
T細(xì)胞免疫療法主要是利用抗腫瘤T細(xì)胞的不同特性來增強(qiáng)T細(xì)胞功能以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，包括TIL療法、免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICB）、癌癥疫苗和過繼性細(xì)胞療法等。其中TIL療法是靶向TME中已存在的抗腫瘤T細(xì)胞，在體外對其擴(kuò)增后再重新高劑量輸回體內(nèi)，使得抗腫瘤反應(yīng)在腫瘤外部位（淋巴結(jié)、外周血、正常組織）得以擴(kuò)大。ICB主要是重新激活TME中的抗腫瘤T細(xì)胞，釋放更多的趨化因子和細(xì)胞因子，而細(xì)胞因子的釋放有利于T細(xì)胞從腫瘤外的部位募集，增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。TIL和ICB都是靶向已存在的抗腫瘤T細(xì)胞，而癌癥疫苗和過繼性細(xì)胞療法有所不同，它們是產(chǎn)生新的抗腫瘤特異性T細(xì)胞。癌癥疫苗可以誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞介導(dǎo)的抗原未經(jīng)歷T細(xì)胞的啟動(dòng)，過繼細(xì)胞療法是直接在體外對T細(xì)胞進(jìn)行改造，在細(xì)胞表面插入天然T細(xì)胞受體（TCR）或嵌合抗原受體（CARs）直接對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。免疫療法誘導(dǎo)的有效抗腫瘤T細(xì)胞可以溶解腫瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)釋放額外的腫瘤抗原（epitope spreading），這些抗原可以由抗原呈遞細(xì)胞呈遞。epitope spreading可以進(jìn)一步促進(jìn)先前存在的反應(yīng)的擴(kuò)增和重新激活，以及誘導(dǎo)新的T細(xì)胞特異性。
圖3.不同T細(xì)胞免疫療法作用方式對比
免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICB）
ICB是實(shí)體瘤中最被廣泛應(yīng)用的免疫療法，其中基于靶點(diǎn)PD1、CTLA4、LAG3已被FDA批準(zhǔn)用于各類實(shí)體瘤的治療，雖然已證明其有效性，但只在少部分患者中達(dá)到持續(xù)或完全緩解。因此有必要在治療前、治療期間或治療后對活檢組織或外周血中T細(xì)胞進(jìn)行克隆跟蹤，以了解ICB對T細(xì)胞組成和功能的影響。
ICB治療的完全或部分應(yīng)答與原生腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)不同的T細(xì)胞組成以及瘤外部位（外周血、正常組織和引流淋巴結(jié)）更廣泛的T細(xì)胞庫有關(guān)。根據(jù)腫瘤類型、分析時(shí)間和臨床環(huán)境，應(yīng)答者可以表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)組織駐留記憶T細(xì)胞樣耗竭T細(xì)胞（Trm-like Tex）的高頻率，具有高細(xì)胞毒性，原始耗竭T （Tpe）細(xì)胞的增加，具有高再生能力，或腫瘤外部位假定的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的擴(kuò)張和浸潤增加，這些特征被認(rèn)為是對ICB反應(yīng)的機(jī)制基礎(chǔ)。相反缺乏這樣的T細(xì)胞群，因此，末端耗竭T （Tte）細(xì)胞的頻率很高，不能實(shí)質(zhì)性地重新激活，使患者容易產(chǎn)生無效的免疫治療反應(yīng)。
患者經(jīng)過ICB治療后，首先通過破壞免疫抑制作用，ICB抗體可以釋放抗腫瘤Trm-like Tex細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，這些細(xì)胞可以在TME內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)大。這種機(jī)制，即所謂的“細(xì)胞毒性恢復(fù)”，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌的新輔助ICB治療（2-4周）后早期觀察到。其次，ICB具有全身性作用，有利于腫瘤外部位的新（或以前未檢測到的）T細(xì)胞特異性的腫瘤內(nèi)浸潤。新招募的T細(xì)胞克隆可能在ICB抗體存在的情況下產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)，這可能會(huì)阻止細(xì)胞毒性的抑制。這種“克隆替代”最初是在基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌患者治療后9周的中位時(shí)間出現(xiàn)的。在一些臨床環(huán)境和癌癥類型中，這些T細(xì)胞庫的系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)已被觀察到作為治療后早期（2-4周）反應(yīng)的預(yù)測。最后，應(yīng)答可以通過祖細(xì)胞或早期功能失調(diào)的腫瘤特異性T細(xì)胞（Tpe細(xì)胞）在TME內(nèi)擴(kuò)增和分化或從淋巴結(jié)和外周組織募集來維持。這已經(jīng)在肺癌和黑色素瘤病變中觀察到，其特征是治療后晚期（1 ~ 2個(gè)月）Tpe細(xì)胞的積累。這種現(xiàn)象被稱為“克隆恢復(fù)”，因?yàn)樗奶攸c(diǎn)是功能失調(diào)程度較低的細(xì)胞的積累，在ICB介導(dǎo)的抑制信號破壞存在的情況下，這些細(xì)胞有可能再生出具有腫瘤細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞的后代。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，上述對ICB的反應(yīng)機(jī)制不是相互排斥的，而是可以代表在治療后不同時(shí)間階段發(fā)生的互補(bǔ)甚至協(xié)同的事件。
圖4.ICB治療前后T細(xì)胞組成和功能分析
癌癥疫苗
癌癥疫苗通過選擇性地富集T細(xì)胞對預(yù)先定義的腫瘤抗原的反應(yīng)性來促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)的重新激活和激發(fā)，通過增加APC介導(dǎo)的癌癥抗原的呈遞，疫苗接種既可以增強(qiáng)預(yù)先存在的腫瘤反應(yīng)，也可以啟動(dòng)T細(xì)胞前體的新生分化，“引導(dǎo)”抗腫瘤免疫反應(yīng)的特異性，使其針對特定的免疫原性抗原。不同的癌癥疫苗，其活性成分不同，包括靶向腫瘤抗原的類型、配方、免疫佐劑和遞送載體等。一些研究通過追蹤循環(huán)T細(xì)胞對目標(biāo)抗原的反應(yīng)性，調(diào)查了癌癥疫苗如何影響T細(xì)胞庫。從這些研究中發(fā)現(xiàn)，高達(dá)60-70%的預(yù)測新抗原能夠誘導(dǎo)反應(yīng)性T細(xì)胞。有趣的是，雖然疫苗接種方案旨在誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞，但應(yīng)答主要由多克隆CD4+ T細(xì)胞組成，這可能是APCs HLA II類分子上長免疫抗原的加工和呈遞所支持的。
通過單細(xì)胞測序和多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析，最近在8例黑色素瘤患者中完成了一種癌癥疫苗誘導(dǎo)的新抗原特異性CD4+ T細(xì)胞的詳細(xì)表征。疫苗反應(yīng)性T細(xì)胞在接種疫苗后的頭幾個(gè)月擴(kuò)大，并在接受治療的患者中持續(xù)4年。在接種疫苗后的早期階段，針對新抗原的CD4+ T細(xì)胞表現(xiàn)出具有激活和衰竭特征的細(xì)胞毒性譜；在治療后收集的腫瘤病變中檢測到它們的TCR，證明了這些細(xì)胞能夠在TME內(nèi)運(yùn)輸。在較晚的時(shí)間點(diǎn)（接種疫苗后5年），擁有相同克隆型的T細(xì)胞表現(xiàn)出記憶表型，至少在循環(huán)中是這樣。
過繼性細(xì)胞療法
過繼性T細(xì)胞療法（ACT）旨在定量和定性地增強(qiáng)抗腫瘤免疫，這可以通過兩種方式實(shí)現(xiàn)：1）擴(kuò)大體內(nèi)已有的抗腫瘤特異性T細(xì)胞（TIL治療）；2）通過使用抗腫瘤TCR或嵌合抗原受體（CARs）進(jìn)行基因操作來重定向體內(nèi)T細(xì)胞的特異性，這可以刺激新生抗腫瘤反應(yīng)。
Rosenberg小組的開創(chuàng)性研究首先證明了從手術(shù)切除的腫瘤碎片中分離的TIL如何在體外擴(kuò)增，篩選對自體腫瘤細(xì)胞的識別，然后再輸注到患者體內(nèi)，這種過繼性TIL治療方法的研究最初達(dá)到了約20%的完全臨床反應(yīng)。TIL治療的一個(gè)主要優(yōu)勢是其多克隆性：對輸注TIL不同批次的分析一致表明，TIL產(chǎn)品含有廣譜的T細(xì)胞特異性，包括TAA、新抗原和癌病毒蛋白。雖然TIL治療是ACT發(fā)展的一個(gè)里程碑，但它受到腫瘤內(nèi)預(yù)先存在的抗腫瘤T細(xì)胞數(shù)量要求的限制，其數(shù)量可能不足以滿足所有患者，特別是在腫瘤突變負(fù)擔(dān)較低的腫瘤類型的背景下，例如黑色素瘤。為了克服這一限制，許多研究小組已經(jīng)將重點(diǎn)放在基因操作上，以工程TCR或CAR的形式重新定向T細(xì)胞對腫瘤抗原的特異性。
使用經(jīng)過基因工程改造的T細(xì)胞來表達(dá)腫瘤特異性TCRs，需要對TCRs進(jìn)行分離、測序和驗(yàn)證，這些TCRs能夠在給定患者的HLA背景下識別腫瘤抗原。因此，這種方法受到了一定的限制，部分原因是由于HLA的高頻率限制導(dǎo)致難以找到針對公共TAAs的高親和力TCR。當(dāng)ACT方法使用針對TAAs的特異性TCR時(shí)，由于其在健康組織上的表達(dá)可能較低，因此需要進(jìn)行廣泛的臨床前測試。通過測序和分離新抗原特異性TCRs來鑒定腫瘤特異性突變，為克服這一障礙提供了一種潛在的解決方案。
CARs的出現(xiàn)徹底改變了ACT領(lǐng)域，因?yàn)檫@樣的結(jié)構(gòu)使得靶向表面腫瘤蛋白以一種不依賴于HLA的方式進(jìn)行。CAR通常需要數(shù)千個(gè)靶表面分子來介導(dǎo)有效的反應(yīng)，只有在確定腫瘤細(xì)胞上具有高、廣泛和保守表達(dá)的表面蛋白時(shí)才可行。這對實(shí)體瘤來說是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樗鼈兙哂泻芨叩牧?strong>內(nèi)克隆異質(zhì)性和免疫抑制潛力；然而在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肉瘤中使用CAR特異性的雙神經(jīng)節(jié)脂苷GD2和人表皮生長因子受體2 （HER2）獲得了令人鼓舞的結(jié)果。相反地，CART細(xì)胞在治療血液腫瘤方面表現(xiàn)出顯著的成功，主要針對表達(dá)CD19、CD20、CD22的B細(xì)胞急性或慢性血液腫瘤。 CAR-重定向T細(xì)胞是一種合成分子，在提供抗原識別的同時(shí)，通過一個(gè)或多個(gè)共刺激內(nèi)結(jié)構(gòu)域（這可能取決于特定的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)）進(jìn)行非生理性的順式共刺激;對于CD19 CAR，即使在清除腫瘤細(xì)胞后，正常B細(xì)胞上也有可能通過識別CD19而產(chǎn)生本構(gòu)性強(qiáng)直CAR信號傳導(dǎo)，臨床表現(xiàn)為B細(xì)胞發(fā)育不全延長。
過繼T細(xì)胞的表型組成影響治療結(jié)果，具有抗腫瘤潛能的輸注T細(xì)胞的質(zhì)量是促進(jìn)其體內(nèi)持久性和轉(zhuǎn)移到癌癥患者后的功能的主要因素?？鼓[瘤T細(xì)胞可以從腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）或外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中擴(kuò)增出來，并且可以通過引入天然T細(xì)胞受體（TCR）或嵌合抗原受體（CARs）來進(jìn)一步操縱它們，使其特異性轉(zhuǎn)向腫瘤抗原。這種T細(xì)胞的體外激活導(dǎo)致具有多種表型的T細(xì)胞擴(kuò)增，一旦T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到癌癥患者體內(nèi)，就會(huì)影響其動(dòng)力學(xué)和功能。輸注產(chǎn)品富含再生潛力低的衰竭T （Tex）細(xì)胞表型（終末衰竭T （Tte）細(xì)胞和組織常駐記憶細(xì)胞樣耗竭細(xì)胞（Trm-like Tex），只能提供短期的抗腫瘤功能，在體內(nèi)迅速下降，因此對癌細(xì)胞的控制有限。事實(shí)上，在接受過繼性T細(xì)胞療法（ACT）治療的患者中，輸注的Tex細(xì)胞克隆在輸注后（2-4周）早期收縮，由此產(chǎn)生的抗腫瘤T細(xì)胞的低持久性與疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)有關(guān)。相反，富含記憶T （Tmem）細(xì)胞的T細(xì)胞產(chǎn)物與轉(zhuǎn)移的抗腫瘤T細(xì)胞的高水平持久性有關(guān)，進(jìn)而與對ACT的反應(yīng)有關(guān)。輸注T細(xì)胞更好的適應(yīng)性來自于具有再生潛力的細(xì)胞（Tmem細(xì)胞）的存在，或者在有限程度上來自于原始耗竭祖細(xì)胞（Tpe）細(xì)胞的存在，這些細(xì)胞可以在體內(nèi)擴(kuò)增、長期存在并分化產(chǎn)生大量的效應(yīng)物，從而成功地控制腫瘤。因此，ACT可以從有利于非耗盡抗腫瘤T細(xì)胞的體外生成和擴(kuò)增的方法中受益。
圖5. 過繼T細(xì)胞表型影響治療療效
總之，體外構(gòu)造T細(xì)胞療法如果富集了具有Tmem細(xì)胞特征的抗腫瘤T細(xì)胞，與體內(nèi)T細(xì)胞持久性和疾病控制有關(guān)，而那些富集了抗腫瘤Tex細(xì)胞的方案在注入患者體內(nèi)后，T細(xì)胞適應(yīng)性就很差。
總結(jié)
隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞TCR-seq、空間轉(zhuǎn)錄組及空間蛋白組等技術(shù)的發(fā)展及其在從癌癥生物標(biāo)本中表征T細(xì)胞庫特性方面的應(yīng)用，使得對患者和臨床前模型中抗腫瘤T細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)的解剖成為可能。通過縱向追蹤患者的這種T細(xì)胞特異性，我們可以更好地了解與產(chǎn)生生產(chǎn)性抗腫瘤反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)力學(xué)。在免疫熱腫瘤中，癌癥的生長伴隨著具有多種抗腫瘤潛力的耗竭T細(xì)胞的誘導(dǎo)，成功的腫瘤控制需要這些功能的重新激活和/或重新布線。隨著T細(xì)胞分析技術(shù)的不斷進(jìn)步及其在人類樣本中的應(yīng)用，我們可以更好地理解成功免疫療法背后的生物學(xué)事件，并將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為新的治療選擇，以促進(jìn)所有癌癥患者的抗腫瘤T細(xì)胞免疫。
