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結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的分子特征
導(dǎo)讀
在結(jié)直腸癌(CRC)患者中，有很多患者在病程中發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移(PM)。PM與較差的生活質(zhì)量和臨床結(jié)局有關(guān)，所以為了改善對這一患者群體的護(hù)理，我們需要更好地了解CRC-PM的分子特征。在下文中，作者分析了52名CRC-PM患者的分子特征，證明CRC-PM代表了一個不同的CRC分子亞型CMS4，并可以進(jìn)一步分為三個不同的類別，每個類別都有獨特的特征。最后，作者定義了CRC-PM的進(jìn)化特征，表明多克隆轉(zhuǎn)移種植是這些病變的基礎(chǔ)?？傊?，作者的研究結(jié)果表明，CRC-PM應(yīng)被視為一種獨特的疾病實體。
文章解讀
作者在52例結(jié)直腸癌患者中，收集了82例新鮮冰凍腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)本和8例配對的原發(fā)癌標(biāo)本。作者根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄圖譜(圖1A)，確定了單發(fā)(n=37)或多發(fā)腹膜病變(n=15)的CMS。雖然觀察到CMS4樣本之間具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，但大多數(shù)腹膜轉(zhuǎn)移病變被歸類為CMS4 (圖1A)。同一患者的多個樣本之間的一致性很高，有13/15的多個樣本的患者在所有病變中顯示相同的分類(圖1B)。作者將82.6%的腹膜轉(zhuǎn)移患者歸類為CMS4，而CMS1、CMS2、CMS3或混合型CMS的發(fā)生率要低得多(圖1B)。與I-IV期原發(fā)結(jié)直腸癌標(biāo)本相比，CMS4在CRC-PM組（轉(zhuǎn)移標(biāo)本）中高度富集(圖1C)。這些結(jié)果表明，CMS4癌癥經(jīng)常伴有腹膜病變。同時在一組II期CRC原發(fā)腫瘤患者中，作者發(fā)現(xiàn)CMS4患者的腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著更高（圖1D，E），佐證了這一觀點。另外，作者對獨立隊列的原發(fā)結(jié)直腸癌和配對的PM組織進(jìn)行CMS分類，進(jìn)一步驗證了這些發(fā)現(xiàn)。
對每個患者進(jìn)行突變分析，作者發(fā)現(xiàn)CMS1分類與MSI（microsatellite instable）和BRAF-V600E突變密切相關(guān)(圖1B)。其中4例MSI樣本全部是CMS4亞型，并且全部來源于粘液性腫瘤(圖1B)。CMS3患者的特征是Smad4突變，但在該類患者中沒有檢測到其他致癌突變。另外所有CMS2患者中均發(fā)現(xiàn)KRAS和TP53突變。作者還發(fā)現(xiàn)，在腹膜轉(zhuǎn)移隊列中，NRAS突變略少，而KRAS突變頻率顯著增加(圖1F)，這高于最近報道的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中KRAS的突變頻率。與上述結(jié)果一致，作者也在原發(fā)II期腫瘤(AMC-AJCCII-90)中檢測到KRAS/BRAF的突變富集以及KRAS信號活性增加，這些腫瘤最終將復(fù)發(fā)為腹膜轉(zhuǎn)移疾病。這些發(fā)現(xiàn)表明，KRAS的激活是腹膜擴(kuò)散的預(yù)測因素?？傊?，在這里作者通過對CMS亞型的分析和突變分析描述了腹膜轉(zhuǎn)移瘤組織的分子特征。
轉(zhuǎn)移灶在CMS亞型之間表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異，CMS2和CMS3的腺體結(jié)構(gòu)整齊，CMS4樣本的間質(zhì)細(xì)胞增多，腫瘤細(xì)胞含量減少。雖然大多數(shù)腹膜病變位于覆蓋腸道的腹膜或大網(wǎng)膜，但CMS2分類的腹膜病變主要來自卵巢，這表明CMS亞型在播種過程中具有特異性。與TCGA數(shù)據(jù)庫中原發(fā)性結(jié)腸癌(COAD)隊列相比，腹膜轉(zhuǎn)移隊列中的粘液性原發(fā)腫瘤顯著富集。以前人們認(rèn)為粘液腺癌類型以前與CMS4、MSI、RAS-MAPK通路突變、總體預(yù)后較差和腹膜轉(zhuǎn)移頻率增加有關(guān)。雖然在作者的腹膜轉(zhuǎn)移隊列中，粘液腺癌與MSI和RAS突變無關(guān)，但它與腹膜癌指數(shù)（PCI）相關(guān)。PCI評分與總生存率(OS)(圖1G)和復(fù)發(fā)死亡率(RFS)密切相關(guān)。相比之下，轉(zhuǎn)移性或同時性腹膜轉(zhuǎn)移（在結(jié)直腸癌確診時即發(fā)現(xiàn)的腹膜轉(zhuǎn)移）患者之間的OS和RFS沒有發(fā)現(xiàn)差異。RAS或BRAF突變不影響OS，然而，作者確實發(fā)現(xiàn)有少數(shù)RAS/BRAF野生型癌癥患者表現(xiàn)出更差的RFS和顯著增加的腫瘤負(fù)荷。由于非CMS4患者數(shù)量較少，作者沒有發(fā)現(xiàn)PCI評分與CMS分型之間有統(tǒng)計學(xué)意義，但大多數(shù)患者的PCI評分較高，被歸類為CMS4(圖1H)。相應(yīng)地，與CMS2、CMS3或混合CMS患者相比，CMS4患者表現(xiàn)出更差的OS(圖1I)。
在本文中，能形成腹膜轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系被稱為CMS4細(xì)胞系(圖2A，B)。為了確定腹膜轉(zhuǎn)移的決定因素，作者進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析，比較了在體內(nèi)能和不能形成腹膜轉(zhuǎn)移的CRC細(xì)胞系 (圖2C) 。這項分析表明，MSN(膜組織延伸刺突蛋白)在形成和不形成腹膜轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系中表達(dá)差異最大(圖2C)。MSN在腹膜轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)腫瘤(圖2D)和CMS4原發(fā)CRCs (圖2E)中的表達(dá)顯著升高，這表明MSN在腹膜病變中的表達(dá)不增加，但在腹膜轉(zhuǎn)移起源的原發(fā)癌中已經(jīng)存在?；颊吒鼓まD(zhuǎn)移組織的染色證實了大量MSN陽性的腫瘤細(xì)胞(圖2F)。此外，與肝轉(zhuǎn)移相比，MSN在腹膜轉(zhuǎn)移中的表達(dá)也顯著增加(圖2G)。MSN蛋白在體內(nèi)腹膜腫瘤的腫瘤邊界表達(dá)最豐富，特別是在腫瘤細(xì)胞與周圍組織相互作用的地方(圖2H) 。在功能上，MSN參與了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附，因為MSN的敲除減少了播種后絲狀足的形成和對膠原蛋白表面的黏附，并減少了3D生長(圖2I-N) 。相反，MSN在CMS2細(xì)胞系中的異位表達(dá)導(dǎo)致了體外絲狀足的形成，這再次強(qiáng)調(diào)了MSN在細(xì)胞附著中的作用。另外，MSN基因敲除導(dǎo)致體內(nèi)腹膜轉(zhuǎn)移減少(圖2O-R)，而這不影響體外生長或體內(nèi)皮下腫瘤生長速度?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明在腹膜轉(zhuǎn)移過程中需要CMS4相關(guān)MSN的表達(dá)。
腹膜轉(zhuǎn)移的患者在進(jìn)展率和癥狀上都表現(xiàn)出顯著的臨床差異?？紤]到CMS4樣本的轉(zhuǎn)錄譜中存在廣泛異質(zhì)性(圖1A)，作者猜測可能存在多個CMS4亞簇。通過進(jìn)一步的分析，作者發(fā)現(xiàn)了3個不同CMS4簇(CMS4-PM.A、B和C)，這三個亞簇具有不同分子和臨床特征 (圖3A)。與CMS4-PM.A相比，作者觀察到CMS4-PM.C亞組更傾向于大網(wǎng)膜作為轉(zhuǎn)移部位，而腫瘤細(xì)胞含量或原發(fā)腫瘤位置的沒有顯著差異(圖3A)。突變分析顯示，在CMS4-PM.A簇中KRAS突變顯著富集，在CMS4-PM.B簇中TP53突變的頻率相對較高(圖3A，B)。在CMS4-PM.B簇中觀察到KRAS和TP53的通路活性明顯降低，而在該簇中發(fā)現(xiàn)的KRAS突變出現(xiàn)的頻率較低，這表明在CMS4-PM.B簇中存在一種不同的、較少依賴KRAS的生物學(xué)機(jī)制(圖3B，C)。進(jìn)一步的基因集富集分析表明，在CMS4-PM.A(RAS突變亞型)中，氧化磷酸化、Myc和活性氧 (ROS)途徑高表達(dá)。而CMS4-PM.B（粘液型）在DNA復(fù)制過程和E2F靶點上顯著富集，KRAS和TP53信號評分比較低，并且具有粘液細(xì)胞類型特征(圖3D)。CMS4-PM.C的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化生長因子-β、KRAS和免疫相關(guān)途徑(炎癥亞型)的表達(dá)水平最高(圖3D)。Bulk-RNA測序的反卷積顯示，除CMS1病變外， CMS4-PM.C簇的樣本具有最高的免疫和基質(zhì)細(xì)胞浸潤(圖3E)。免疫細(xì)胞的進(jìn)一步去卷積表明，CMS4亞組之間的免疫細(xì)胞群組成也不同，CMS4-PM.B中髓系細(xì)胞的相對豐度較少(圖3F)。在CMS4-PM.C(炎癥亞型)樣本中，PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3或TIGIT等免疫檢查點抑制分子的基因表達(dá)上調(diào)，這表明這些腫瘤中存在免疫抑制微環(huán)境(圖3G)。為CRC患者的治療提供了新的研究思路。在臨床上，CMS4-PM.B病變的患者表現(xiàn)出較高的PCI評分(圖3H)，而與其他兩個亞型相比，OS更差 (圖3I)。
結(jié)直腸癌細(xì)胞種植后，會在腹膜表面發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移。與內(nèi)臟器官(如肝臟)的轉(zhuǎn)移不同，腹膜沒有預(yù)先存在的基質(zhì)環(huán)境，比如器官內(nèi)的成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。。腹膜病變會吸引不同類型的細(xì)胞，但目前尚不清楚這種現(xiàn)象與原發(fā)性腫瘤部位的間質(zhì)成分有何關(guān)系。為了解釋這一現(xiàn)象，作者將來自同一患者的原發(fā)腫瘤和腹膜轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行配對研究。轉(zhuǎn)錄組分析顯示匹配的一對之間具有高度相似性(圖4A)。相反，肝轉(zhuǎn)移瘤并未與其配對的原發(fā)性腫瘤反映出不同的微環(huán)境(圖4B)。與原發(fā)性腫瘤相比，作者只有在一小部分腹膜轉(zhuǎn)移樣本中，觀察到了CMS亞型的轉(zhuǎn)換(圖4C)，而在肝轉(zhuǎn)移中CMS亞型的轉(zhuǎn)換更為常見(圖4D)。另外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的去卷積證實原發(fā)性結(jié)直腸癌和腹膜轉(zhuǎn)移瘤的上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的組成高度保守(圖4E，F(xiàn))。接下來，作者對6例冰凍標(biāo)本進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，其中包括1對配對的原發(fā)性結(jié)直腸癌和腹膜轉(zhuǎn)移瘤。對26,570個細(xì)胞的聚類分析顯示存在不同的細(xì)胞類型(圖4G)。而不同患者的上皮細(xì)胞是分開聚類的，免疫和基質(zhì)細(xì)胞類型按細(xì)胞類型聚類在一起，與患者來源無關(guān)(圖4G)。配對的原發(fā)性腫瘤和腹膜轉(zhuǎn)移瘤的上皮細(xì)胞明顯聚集在一起，這表明上皮細(xì)胞在患者體內(nèi)的相似性很高，而在患者間顯示出高度的異質(zhì)性(圖4H)。總之，在CRCs中，腹膜轉(zhuǎn)移瘤囊括了原發(fā)癌的表型和細(xì)胞組成。
拷貝數(shù)變異(CNV)分析表明，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，腹膜和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的獲得/丟失頻率分布與CRCs高度相似。然而，通過分析單個CNV圖譜，作者發(fā)現(xiàn)腹膜和肝臟轉(zhuǎn)移瘤樣本之間有一些顯著的差異。首先，與出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移的患者相比，原發(fā)性腫瘤和腹膜轉(zhuǎn)移瘤的CNV都要低得多(圖4I)。同樣，與肝轉(zhuǎn)移患者相比，原發(fā)性結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移癌患者的拷貝數(shù)異質(zhì)性(CNH)顯著低且更穩(wěn)定。直接比較轉(zhuǎn)移瘤和配對的原發(fā)性結(jié)直腸癌CNV特征，作者發(fā)現(xiàn)與肝轉(zhuǎn)移瘤相比，腹膜病變與其原發(fā)性腫瘤更相似(圖4J)。另外，作者通過對配對的原發(fā)癌和腹膜轉(zhuǎn)移瘤的單細(xì)胞CNV分析證實原發(fā)癌和腹膜轉(zhuǎn)移瘤之間具有高度保守的CNV圖譜和克隆異質(zhì)性(圖4K)?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，與肝臟相比，腹膜轉(zhuǎn)移是一個獨特的、CMS4特異性的轉(zhuǎn)移過程，腹膜轉(zhuǎn)移瘤保留了原發(fā)腫瘤的克隆異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄特征(圖4L)。
全文總結(jié)
本篇文章對CRC衍生的PM隊列進(jìn)行分子表征，發(fā)現(xiàn)其主要分子亞型是CMS4，并且富含KRAS突變。CMS4亞型進(jìn)一步能夠細(xì)分為具有不同特征的三個亞組。與CMS4相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白Moesin在腹膜播散中起著關(guān)鍵作用。此外，作者還定義了CRC-PM的特定進(jìn)化特征，表明這些病變由多克隆轉(zhuǎn)移性播種造成。因此，作者認(rèn)為，CRC-PM應(yīng)被視為一種獨特的疾病實體。
參考文獻(xiàn)
1. Lenos KJ, Bach S, Ferreira Moreno L, et al. Molecular characterization of colorectal cancer related peritoneal metastatic disease. Nat Commun 2022; 13(1): 4443.
