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各位小伙伴們大家好呀，癌癥研究大家可能已經(jīng)見多識廣啦。今天小編給大家?guī)戆l(fā)表在Cell Discovery(IF=38.079)上的一篇關(guān)于癌癥并發(fā)癥的單細(xì)胞研究。作者對于癌癥相關(guān)惡病質(zhì)這一臨床問題通過單細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了詳細(xì)的剖析，快來和小編一起看看吧！
一.研究背景
癌癥相關(guān)惡病質(zhì)(cancer-associated cachexia,CAC)是一種病因復(fù)雜的綜合征，其特征是骨骼肌和脂肪組織的顯著耗竭。CAC患者通常表現(xiàn)為食物攝入減少、能量消耗升高、分解代謝過剩和系統(tǒng)性炎癥。CAC的發(fā)生會增加患者死亡率并降低生活質(zhì)量以及放療化療的療效。
白色脂肪組織(white adipose tissues,WAT)由不同的細(xì)胞成分組成。除脂肪細(xì)胞和脂肪干祖細(xì)胞(ASPCs)外，WAT中還存在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及多種類型的常駐和浸潤的免疫細(xì)胞?？傊@些細(xì)胞調(diào)節(jié)脂肪微環(huán)境，并在代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。于是作者通過分析來自有或沒有CAC的個體的內(nèi)臟和皮下庫的人脂肪組織的單細(xì)胞表達(dá)譜，描述了與惡病質(zhì)發(fā)展相關(guān)的不同細(xì)胞類型和/或不同儲存庫的特異性，揭示了對惡病質(zhì)的儲存庫特異性和疾病特異性細(xì)胞反應(yīng)以及導(dǎo)致CAC脂肪組織消耗的細(xì)胞免疫反應(yīng)改變。
二.主要結(jié)果
1.脂肪組織中非脂肪細(xì)胞部分細(xì)胞群的鑒定
作者對8例胃癌患者(4例非惡病質(zhì)、4例惡病質(zhì))的SAT和VAT脂肪樣本的間質(zhì)血管組分(SVFs)進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序(scRNA- seq)。經(jīng)過質(zhì)量控制，最終保留33856個細(xì)胞進(jìn)行下游分析；經(jīng)過聚類及標(biāo)記基因注釋(圖1b)分為9個主要的細(xì)胞群(圖1a)。作者觀察到：惡病質(zhì)組和非惡病質(zhì)組不同細(xì)胞類型的分布在VAT和SAT上無明顯差異；但是，VAT和SAT不同細(xì)胞類型的百分比有明顯的差異，VAT中有更多的免疫浸潤(圖1c、d)；SAT中含有較多的血管細(xì)胞，與觀察到的SAT血管化良好一致。CAC患者SVF中免疫細(xì)胞比例明顯高于VAT(圖1d)。
2.在VAT和SAT中鑒定出不同的祖細(xì)胞群
在這一部分，作者對VAT和SAT中的祖細(xì)胞群進(jìn)行了詳細(xì)分析。經(jīng)過分析，作者將脂肪干細(xì)胞和祖細(xì)胞(adipose stem and progenitor cells, ASPCs)聚類為12簇，每一簇均表達(dá)高水平的CD34、FDGFRA和THY1(圖2a)。表達(dá)高水平MGP、CXCL14、APOD被注釋為成脂祖細(xì)胞；高表達(dá)FMO2基因的簇主要分布在VAT中，因此被標(biāo)記為內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞(vPreA)；高表達(dá)FABP4和APOE的簇表明更傾向于成為成熟的脂肪細(xì)胞，被標(biāo)記為皮下前脂肪細(xì)胞(sPreA)；除此之外，作者還注釋發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞(HSC)以及炎癥祖細(xì)胞(inflammatory progenitor cells)（圖2a）。
對SAT中脂肪生成祖細(xì)胞的軌跡分析發(fā)現(xiàn)了兩種不同的轉(zhuǎn)變，即從ASC開始向sPreA或vPreA和成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，這表明了sPreA和vPreA在脂肪生成中的內(nèi)在區(qū)別是由分叉的發(fā)育軌跡決定的(圖2b)。然后，作者通過GO分析顯示，與VAT相比，SAT的前脂肪細(xì)胞線粒體功能和脂肪酸代謝增強(qiáng)(圖2c)。通路富集分析也顯示，SAT中PPAR信號通路活性較高，表現(xiàn)為FABP4、FABP5、ANGPTl4、LPL和CD36的表達(dá)相對較高，與SAT中大多數(shù)祖細(xì)胞為前脂肪細(xì)胞的觀察結(jié)果一致(圖2d、e)。
3.SAT和VAT中脂肪祖細(xì)胞的惡病質(zhì)特異性改變
作者進(jìn)一步分析了惡病質(zhì)和非惡病質(zhì)患者在不同脂肪儲存庫(SAT和VAT)中可能的祖細(xì)胞變化(圖3a)。作者觀察到，與無惡病質(zhì)的患者相比，在惡病質(zhì)組的vPreA中，主要調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的基因，包括CEBPB,CEBPD,BMP2和KLF4明顯降低(圖3b、c)。此外，簇10被標(biāo)記為ITLN1和MSLN特異性表達(dá)的間皮源性祖細(xì)胞，幾乎只在非惡病質(zhì)患者的VAT中發(fā)現(xiàn)(圖3d)。作者進(jìn)一步對簇8(也被稱為炎癥祖細(xì)胞)中上調(diào)的基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)顯著富集，提示炎癥反應(yīng)被激活(圖3e)。
作者假設(shè)SAT中惡病質(zhì)特異性炎癥祖細(xì)胞的發(fā)生可能是由腫瘤衍生因子引起的，通過scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定的標(biāo)記基因，包括CCL2,CXCL2,TNFAIP6和TNFRSF12A表明腫瘤細(xì)胞將脂肪生成祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為炎癥祖細(xì)胞，證明其假設(shè)。進(jìn)一步，作者通過細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)論(圖3f)。這些結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞分泌的某些蛋白質(zhì)至少部分地促進(jìn)了祖細(xì)胞中活化的趨化因子基因表達(dá)，特別是在惡病質(zhì)患者中。
4.巨噬細(xì)胞在惡病質(zhì)患者中表現(xiàn)為促炎轉(zhuǎn)變，并可能加重脂肪消耗
髓系細(xì)胞對惡病質(zhì)的影響仍不確定。因此，作者對脂肪組織中的巨噬細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)的分析。基于巨噬細(xì)胞的marker基因，作者鑒定了三種具有獨(dú)特高表達(dá)基因的不同亞型，并推斷了它們潛在的病理生理功能：存在于各種組織中，高表達(dá)LYVE1、SELENOP以及CD163的血管周圍巨噬細(xì)胞(PVM)；特征為MHC-Ⅱ的高表達(dá)和低表達(dá)LYVE1類似于巨噬細(xì)胞的一種亞型，作者定義為非血管周圍巨噬細(xì)胞(NPVM)；以及主要在VAT中檢測到的脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LAM)。
作者發(fā)現(xiàn)CAC組兩庫(SAT和VAT)的脂肪組織巨噬細(xì)胞(ATM)占免疫細(xì)胞的比例均降低(圖4a)。接下來通過結(jié)腸腺癌小鼠模型作者發(fā)現(xiàn)，在惡病質(zhì)條件下，VAT中巨噬細(xì)胞的比例明顯下降，而SAT中巨噬細(xì)胞的比例沒有下降，與scRNA測序結(jié)果一致(圖4b)；此外，作者還發(fā)現(xiàn)附睪WAT(epididymal white adipose tissues,eWAT)的重量與脂肪組織中巨噬細(xì)胞的豐度呈正相關(guān)(圖4c)。如圖4d所示，脂代謝相關(guān)基因，如CEBPD和ACSL1，在無CAC患者的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因中富集。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析表明，在CAC發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞清除后，eWAT的體重下降顯著減少，脂肪組織重量更重，脂肪細(xì)胞更大(圖4e-i)。此外，在氯磷酸二鈉脂質(zhì)體處理的小鼠脂肪組織中，脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表達(dá)和激素敏感性脂肪酶(HSL)的磷酸化均降低，這表明在eWAT中脂肪分解的活化程度較低(圖4j、k)。在這個過程中作者還發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的mRNA和蛋白表達(dá)水平在惡病質(zhì)發(fā)展時增加，在氯磷酸二鈉脂質(zhì)體處理后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(圖4l、m)。最終，作者得出結(jié)論：在惡病質(zhì)發(fā)展過程中，VAT中巨噬細(xì)胞的促炎轉(zhuǎn)化可能顯著促進(jìn)脂肪丟失。
5.CD8+T細(xì)胞在惡病質(zhì)患者的VAT中也表現(xiàn)出促炎特征和增強(qiáng)的細(xì)胞溶解效應(yīng)活性
在這一部分，作者對淋巴系細(xì)胞進(jìn)行分析。脂肪組織中的免疫細(xì)胞主要由T/NK細(xì)胞組成，作者對T/NK細(xì)胞進(jìn)行了重新聚類注釋(圖5a、b)。如圖5c、d所示，大部分的T細(xì)胞都來源于VAT，于是作者重點(diǎn)關(guān)注了CAC期間VAT中的免疫微環(huán)境改變。
接下來，作者使用Monocle推斷狀態(tài)軌跡，探索了CD8+T細(xì)胞的動態(tài)免疫狀態(tài)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移(圖6a)。具有較高細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)的TEMRA出現(xiàn)在軌跡分支的一端，TRM出現(xiàn)在中間狀態(tài)，終止于激活的TEM(圖6a)；CAC組的CD8+T細(xì)胞出現(xiàn)在較晚的階段(圖6b)，表明其具有活化性質(zhì)。差異基因表達(dá)分析顯示，在惡病質(zhì)患者中，代表活化狀態(tài)的基因表達(dá)顯著升高；與非惡病質(zhì)患者效應(yīng)記憶性CD8+T細(xì)胞比例較高一致，與功能失調(diào)表型和失活狀態(tài)相關(guān)的基因如MT1X、MT1E、IL7R和ZFP36L2在非惡病質(zhì)患者CD8+T細(xì)胞中高表達(dá)(圖6c)。
為了進(jìn)一步證實(shí)在CAC發(fā)展過程中，更多高細(xì)胞毒性的活化CD8+T細(xì)胞浸潤到脂肪組織中，作者收集了另外8例接受手術(shù)治療的胃癌患者的脂肪組織，通過免疫組織化學(xué)染色對GZMB+細(xì)胞進(jìn)行了染色(圖6d)。作者發(fā)現(xiàn)染色GZMB+細(xì)胞的數(shù)量與脂肪細(xì)胞的大小有很強(qiáng)的相關(guān)性(圖6e)，提示由癌癥相關(guān)因素觸發(fā)的脂肪組織局部組織分解代謝與細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤之間的存在一定的關(guān)聯(lián)。通過對食管癌或胃癌的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)反卷積分析，作者推斷體重減輕患者的VAT中細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的百分比增加(圖6f)。圖6g顯示，惡病質(zhì)患者脂肪組織SVF中多種細(xì)胞類型的TNF和TNFSF12表達(dá)普遍增加，而這些SVF細(xì)胞中IL6或IL1B的表達(dá)沒有顯著增加，這表明成熟脂肪細(xì)胞可能是主要來源。
體外共培養(yǎng)成熟脂肪細(xì)胞和活化的原代CD8+T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)一天后脂肪細(xì)胞中脂滴的大小顯著減少，培養(yǎng)上清液中甘油的濃度增加，表明脂肪的溶脂作用增強(qiáng)(圖6h-j)；脂肪細(xì)胞中HSL磷酸化水平也一致升高(圖6k、l)。綜上這些結(jié)果，作者提出結(jié)論：活化的CD8+T細(xì)胞在體外對脂肪細(xì)胞具有促進(jìn)分解代謝的功能；在惡病質(zhì)發(fā)展過程中，活化的CD8+T細(xì)胞可能通過產(chǎn)生更多的IFN-γ，促進(jìn)脂肪分解代謝。
6.細(xì)胞相互作用分析預(yù)測了惡病質(zhì)中人類WAT相互作用組的重塑
由于VAT中某些免疫細(xì)胞類型的結(jié)構(gòu)和功能表型的顯著變化，作者在這一部分探索激活狀態(tài)的這種轉(zhuǎn)變在多大程度上影響細(xì)胞通信?；贑ellPhoneDB分析，作者發(fā)現(xiàn)：在CAC的的背景下，免疫細(xì)胞之間的配體受體對數(shù)量較多, 尤其是涉及巨噬細(xì)胞的(圖7a)。進(jìn)一步作者使用Connectome web分析來揭示CAC過程中巨噬細(xì)胞的潛在靶細(xì)胞，分析顯示巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞和cDC2Bs具有相似的連通性(圖7b)；進(jìn)一步作者提取了CAC過程中與CD8+T細(xì)胞的高表達(dá)相互作用，揭示了與巨噬細(xì)胞的潛在相互作用(圖7c)。綜上結(jié)果，在惡病質(zhì)患者的脂肪組織中發(fā)生著細(xì)胞相互作用的急劇重塑，包括脂肪祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等。
至此，這篇文章就介紹完啦?？偨Y(jié)起來，這篇文章基于癌癥相關(guān)惡病質(zhì)(CAC)這個臨床上較為嚴(yán)重的綜合征，通過對皮下脂肪組織(SAT)和內(nèi)臟脂肪組織(VAT)的單細(xì)胞測序分析以及多種實(shí)驗(yàn)分析，描繪了惡病質(zhì)發(fā)展相關(guān)的不同細(xì)胞類型和/或不同脂肪儲存庫的特異性以及細(xì)胞反應(yīng)，揭示了導(dǎo)致CAC脂肪組織消耗的細(xì)胞免疫反應(yīng)改變。這為理解CAC的發(fā)生以及臨床治療方法的開發(fā)提供了幫助。縱觀全篇，生信分析都是基礎(chǔ)的單細(xì)胞分析，小編覺得這篇文章最大的亮點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)與生信分析的完美結(jié)合以及每個結(jié)果對所研究問題的環(huán)環(huán)相扣，這些非常值得我們學(xué)習(xí)！
