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基于lncRNA的胰腺癌預(yù)后風(fēng)險評估因素
描繪跨泛癌水平的生物學(xué)功能
這次小編為大家解讀一篇涉及泛癌和免疫的lncRNA研究文章，這篇文章利用lncRNA的表達(dá)構(gòu)建預(yù)后模型，識別到與胰腺癌顯著相關(guān)的lncRNA，并對關(guān)鍵的lncRNA進(jìn)行泛癌水平的分析，檢驗(yàn)他們與免疫的相關(guān)性，本文還有一個新奇的部分就是利用TCGA泛癌表型數(shù)據(jù)和lncRNA表達(dá)構(gòu)建了人體解剖熱圖，值得我們學(xué)習(xí)。
“基于lncRNA的胰腺癌預(yù)后風(fēng)險評估因素描繪跨泛癌水平的生物學(xué)功能”于2021年6月發(fā)表在Frontiers in Cell and Developmental Biology雜志上，影響因子6.684。
研究背景
胰腺癌的早期研究取得了一些進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個胰腺癌相關(guān)基因。然而，對胰腺癌潛在機(jī)制的全面了解仍然有限。最近的研究表明，lncRNAs可能提供新的見解并有助于進(jìn)一步的胰腺癌研究。
多項(xiàng)研究描述了一些lncRNA對胰腺癌患者預(yù)后的影響，并建立了多種預(yù)后風(fēng)險模型。然而，這些研究有幾個缺點(diǎn)，包括數(shù)據(jù)樣本、算法和療效評估方面的局限性。此外，這些研究并未將其模型應(yīng)用于泛癌研究或探索lncRNA的功能。
在這項(xiàng)研究中，作者旨在構(gòu)建一個可靠的胰腺癌預(yù)后lncRNA模型和泛癌分析。共分析了TCGA數(shù)據(jù)中178名胰腺癌患者腫瘤組織的lncRNA表達(dá)譜，以及GTEx數(shù)據(jù)庫中正常胰腺樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)用于校正非腫瘤和癌癥樣本數(shù)量的不平衡。對重要的lncRNA進(jìn)行了泛癌分析，以探索lncRNA作為多種腫瘤預(yù)后分子標(biāo)志物的可能性。
流程簡介：
研究結(jié)果
6-lncRNA的胰腺癌預(yù)后風(fēng)險評分模型
為了識別與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)的潛在 lncRNA，作者使用來自 TCGA 和 GTEx 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集作為組合數(shù)據(jù)集。 對從訓(xùn)練數(shù)據(jù)中的組合數(shù)據(jù)集中分析的差異基因進(jìn)行了單因素 Cox 比例風(fēng)險回歸分析。 共獲得112個與胰腺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)的lncRNA。在LASSO回歸分析后，刪除了具有高相關(guān)性或從屬候選者的 lncRNA，并保留了 12 個具有高度獨(dú)立性的生存相關(guān)的lncRNA。
圖1篩選與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA：(A)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA的LASSO回歸分析結(jié)果 (B) 預(yù)后相關(guān) lncRNA LASSO回歸分析中的交叉驗(yàn)證
基于來自組合數(shù)據(jù)集的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的多因素 Cox 回歸分析篩選出六個預(yù)后 lncRNA。基于六個與生存相關(guān)的 lncRNA 構(gòu)建了一個預(yù)后風(fēng)險評分模型。
公式：
如圖所示，在 6 個 lncRNA 中， AP005264.1 和 AC093895.1 的HR大于 1.0，表明它們是危險因素。AL590438.1、TSPOAP1-AS1、AC005696.1和Z92544.2的HR小于1.0，表明它們是保護(hù)因素。
圖1： (C) 6-lncRNA 標(biāo)記的風(fēng)險比森林圖
基于6-lncRNA模型的生存預(yù)測模型構(gòu)建
根據(jù) 6-lncRNA 預(yù)后風(fēng)險評分模型計(jì)算了訓(xùn)練集中每個胰腺癌患者的分?jǐn)?shù)。根據(jù)訓(xùn)練集中患者的中位數(shù)得分，將患者分為高危組和低危組。高危組患者的平均生存時間明顯低于低危組患者的平均生存時間。Kaplan-Meier 分析表明，兩組之間的總生存時間存在顯著差異（圖 2A）。訓(xùn)練組5年6-lncRNA模型的AUC達(dá)到0.804（圖2B），表明預(yù)后風(fēng)險評分模型預(yù)測了胰腺癌的5年生存率。在訓(xùn)練集中，胰腺癌患者風(fēng)險評分、生存狀態(tài)以及6個lncRNA在高、低風(fēng)險組中的表達(dá)分布如圖2C所示。
圖 2 6-lncRNA 在訓(xùn)練集和測試集中的性能評估：(A) 高危組和低危組的生存曲線分析 (B) 6-lncRNA 標(biāo)記的 5 年 ROC 評估曲線 (C) 患者風(fēng)險評分、生存狀態(tài)和 lncRNA 標(biāo)志物表達(dá)譜
接下來計(jì)算了測試集中的中位數(shù)得分，并將測試數(shù)據(jù)集分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。Kaplan-Meier分析表明，兩組之間的OS存在顯著差異（圖2D），這與訓(xùn)練集中的結(jié)果相似。6-lncRNA 測試集中模型的 AUC 為 0.733（圖 2E）。這些結(jié)果表明，預(yù)后風(fēng)險評分模型在預(yù)測測試集中胰腺癌患者的 5 年生存率方面是可靠的。圖 2F顯示了高危組和低危組的風(fēng)險評分、生存時間、死亡人數(shù)和 6 種 lncRNA 的表達(dá)情況。
圖 2：(D) 測試集中高低風(fēng)險組的 KM 分析 (E) 測試集中 6-lncRNA 標(biāo)記的 5 年 ROC 評估曲線 (F) 測試集中的患者風(fēng)險評分、生存狀態(tài)和 lncRNA 標(biāo)記表達(dá)譜
胰腺癌患者的2-lncRNA預(yù)后風(fēng)險評分模型及生存預(yù)測分析
作者在沒有GTEx數(shù)據(jù)集的情況下對 TCGA 胰腺癌患者的整體數(shù)據(jù)集進(jìn)行了生存分析。共有46個lncRNA與胰腺癌患者的OS顯著相關(guān)。在單變量Cox比例風(fēng)險回歸分析后，獲得了7個 lncRNA，將其輸入多變量Cox比例風(fēng)險回歸分析。最后，獲得了具有兩種lncRNA的胰腺癌患者的預(yù)后風(fēng)險評分模型。lncRNA MIR600HG和TSPOAP1-AS1的HR小于1.0，表明它們是胰腺癌預(yù)后的保護(hù)因素（圖3A）。
圖 3 2-lncRNA 的存活分析：(A) 2-lncRNA標(biāo)記的風(fēng)險比森林圖
使用2-lncRNA預(yù)后風(fēng)險評分模型的中值，將TCGA胰腺癌患者樣本分為高危組和低危組。 Kaplan-Meier 分析顯示高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的 OS 存在顯著差異（圖 3B）。 此外，模型5年的AUC為0.751（圖3C），表明2-lncRNA標(biāo)志物在預(yù)測測試集中胰腺癌患者的5年生存率方面具有可靠的性能。
圖 3：(B) 2-lncRNAs 高低風(fēng)險組的 KM 生存曲線 (C) 2-lncRNAs 五年存活率的 ROC 曲線
在高危組和低危組之間，對預(yù)后風(fēng)險模型中的兩個 lncRNAs 進(jìn)行排序，并在風(fēng)險評分、總生存時間和生存狀態(tài)方面進(jìn)行比較（圖 3D）。
圖 3：(D) 2-lncRNA 高低風(fēng)險組的比較
預(yù)后風(fēng)險評分模型中與關(guān)鍵 lncRNA 相關(guān)的基因
從胰腺癌的所有基因表達(dá)譜中，獲得了19,658 個蛋白質(zhì)編碼基因PCG 和 14,142 個非蛋白質(zhì)編碼的lncRNA。標(biāo)準(zhǔn)化后，獲得了16,988個PCG。 在來自兩個模型的 lncRNA 中，選擇lncRNA TSPOAP1-AS1 和 lncRNA MIR600HG。 對于這兩個關(guān)鍵的lncRNA，與胰腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)化PCG表達(dá)數(shù)據(jù)集一一進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析。總共獲得了1673 個與 TSPOAP1-AS1 相關(guān)的 PCG 和 2172 個與 MIR600HG相關(guān)的PCG。
與TSPOAP1-AS1相關(guān)的PCGs富集到27個GO terms，主要涉及7個功能（細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)橋接等）。KEGG通路分析顯示PCGs主要富集于免疫細(xì)胞活化、抗炎反應(yīng)等5條通路（圖4A）。
圖 4 TSPOAP1-AS1 和 MIR600HG 相關(guān)基因和功能富集： (A) TSPOAP1-AS1相關(guān)基因的GO富集和KEGG通路富集
MIR600HG 的相關(guān)PCG 顯示出 28 個富集的 GO terms，主要集中在五個生物過程和功能上（嘌呤核苷代謝、尿苷環(huán)化酶激活等）。KEGG 通路與白細(xì)胞遷移、癌組織蛋白多糖調(diào)節(jié)等有關(guān)（圖 4B）。
圖 4：(B) MIR600HG相關(guān)基因的GO富集和KEGG通路富集
這兩個lncRNA也參與了泛癌的多種癌癥相關(guān)通路。使用GSEA分析發(fā)現(xiàn)，在膽管癌中，TSPOAP1-AS1參與淋巴細(xì)胞活化、B細(xì)胞活化、免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，而MIR600HG則負(fù)調(diào)節(jié)一些細(xì)胞信號通路如甲基化 CpG 蛋白調(diào)節(jié)、DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和 RNA 聚合酶結(jié)合等。
非癌組織和泛癌中的 lncRNA 基因分析
基因在組織中與不同性別之間的表達(dá)存在差異。利用GTEx數(shù)據(jù)庫中的正常人體組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)和33種腫瘤類型的表型文件和關(guān)鍵lncRNA表達(dá)水平，構(gòu)建了目標(biāo)基因在組織中表達(dá)的健康人體解剖圖。其中，作者對器官和性別進(jìn)行了分類，并繪制了每個器官中靶基因lncRNA表達(dá)的醫(yī)學(xué)解剖圖。采用Wilcox統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算lncRNA在33種癌癥中的差異表達(dá)。一般來說，這兩種 lncRNA在所有組織中都低表達(dá)。TSPOAP1-AS1在脾臟中表達(dá)最高，在腦和肺組織中高表達(dá)。男性腸道系統(tǒng)和女性長骨中TSPOAP1-AS1 的表達(dá)水平較高。MIR600HG 在腎組織中表達(dá)相對較高，而在肺組織、雄性腸道和雌性骨骼肌中表達(dá)水平較低（圖 5A、B）。
圖 5正常人體器官和泛癌的靶基因分析： (A) TSPOAP1-AS1 在男性和女性正常人體器官中的表達(dá) (B)MIR600HG 在男性和女性正常人體器官中的表達(dá)
接下來檢查了 33 種腫瘤類型的腫瘤組織和正常組織中兩種lncRNA的基因表達(dá)。TSPOAP1-AS1在膀胱癌和10種癌癥中顯著升高或降低，在宮頸癌和肺腺癌中的表達(dá)也顯示出顯著差異。還檢測到MIR600HG 在 10 種癌癥中的顯著差異表達(dá)，包括乳腺癌和結(jié)腸癌（圖 5C）。
圖 5 ：(C) TSPOAP1-AS1 和 MIR600HG 在 33 個腫瘤中的表達(dá)差異
根據(jù) TSPOAP1-AS1KM 和 MIR600HG 的中位表達(dá)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并檢查了 33 種癌癥的OS。 在 PAAD、LUAD、READ 和 THYM 等癌癥中，高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的 OS 存在顯著差異，其中 PAAD 的差異最顯著。在 MIR600HG 低表達(dá)和高表達(dá)組中，OV 和 PAAD 患者之間存在顯著的預(yù)后差異（圖 5D）。
圖 5： (D) TSPOAP1-AS1 和 MIR600HG 在多個癌癥患者中的生存曲線分析
使用 lncRNA 的表達(dá)對 33 種癌癥進(jìn)行了 Cox 比例風(fēng)險回歸分析。TSPOAP1-AS1與HNSC和PAAD患者的預(yù)后具有顯著相關(guān)性，是預(yù)后的低風(fēng)險因素。MIR600HG 與 PAAD 患者的預(yù)后顯著相關(guān)，也是一個低風(fēng)險因素（圖 5E）。
圖 5.：(E) TSPOAP1-AS1 和 MIR600HG 風(fēng)險比森林圖
在各種癌癥中檢測到高表達(dá)組和低表達(dá)組之間疾病相關(guān)存活率的顯著差異，PAAD觀察到高度顯著性。
TSPOAP1-AS1 是 KICH 預(yù)后的高危因素以及其他癌癥類型的低危因素。 MIR600HG是PCPG預(yù)后的高危因素和其他癌癥的低危因素。
COAD中TSPOAP1-AS1的表達(dá)檢測到無病生存期存在顯著差異，COAD和KIRP中TSPOAP1-AS1表達(dá)水平差異顯著，是這兩種癌癥患者預(yù)后的高風(fēng)險因素。在 LUSC、PAAD 和 PRAD 中觀察到高和低MIR600HG 風(fēng)險組之間的顯著差異，并且在許多癌癥如 PAAD 中觀察到顯著的預(yù)后差異，其中 MIR600HG 是 PAAD 和 THCA 的低風(fēng)險因素。
在無進(jìn)展生存分析中，高風(fēng)險組和低風(fēng)險組在各種癌癥中都顯示出顯著的生存差異。兩種 lncRNA 的高危組和低危組在 PAAD 中的生存率顯示出顯著差異。TSPOAP1-AS1是多種癌癥的重要預(yù)后因素，其中TSPOAP1-AS1是UVM的高危因素。MIR600HG 是 PAAD 和 PRAD 等許多癌癥的重要預(yù)后因素，其中 MIR600HG 是 PAAD 的低風(fēng)險因素。
接下來對兩種 lncRNA表達(dá)與33 種癌癥類型患者臨床分期之間的相關(guān)性進(jìn)行了非參數(shù) Kruskal 檢驗(yàn)分析。 TSPOAP1-AS1在HNSC、KIRP、LIHC、LUAD、SKCM、TGCT和THCA中的表達(dá)在臨床分期上表現(xiàn)出顯著差異，其中HNSC和LUAD表現(xiàn)最為顯著。TSPOAP1-AS1的表達(dá)在HNSC臨床I期和II期臨床胰腺癌樣本之間存在顯著差異，III期和IV期臨床胰腺癌樣本之間的差異更大。在LUAD中，I期臨床胰腺癌樣本與II期和III期臨床胰腺癌樣本之間也存在高度顯著差異，I期和IV期臨床胰腺癌樣本之間也存在顯著差異。MIR600HG與KIRC、PAAD及10種癌癥的臨床分期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性；MIR600HG的表達(dá)在KIRC III期臨床胰腺癌樣本和IV期臨床胰腺癌樣本中具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5 F）。
圖 5： (F) TSPOAP1-AS1 和 MIR600HG 與各種癌癥臨床分期之間的相關(guān)性
獲得突變總數(shù)以獲得腫瘤突變負(fù)荷（TMB）并計(jì)算TSPOAP1-AS1和MIR600HG在每個腫瘤中TMB與其表達(dá)之間的Spearman相關(guān)系數(shù)。發(fā)現(xiàn) TSPOAP1-AS1 在 THYM 和 PAAD中與 TMB 呈負(fù)相關(guān)，而 MIR600HG 在 PAAD中與 TMB 呈低負(fù)相關(guān)（圖 5G ）。
圖 5： (G) TSPOAP1-AS1 和 MIR600HG 與泛癌 TMB 之間的相關(guān)性，藍(lán)色值是相關(guān)系數(shù)的標(biāo)度
接下來，對lncRNA和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。MSI 數(shù)據(jù)來自 Bonneville 等人關(guān)于泛癌 MSI的研究結(jié)果。本研究通過計(jì)算腫瘤-正常組織配對樣本中各微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因的分布差異，取平均值作為腫瘤-正常組織配對的MSI評分值，計(jì)算出TCGA數(shù)據(jù)庫中大部分腫瘤樣本的MANTIS評分。 TSPOAP1-AS1與大多數(shù)癌癥類型的MSI呈負(fù)相關(guān)或沒有相關(guān)性，而MIR600HG 在更多腫瘤中與 MSI 具有更高的相關(guān)性（圖 5H）。
圖 5.：(H) TSPOAP1-AS1、MIR600HG 和泛癌 MSI 之間的相關(guān)性，綠色值是相關(guān)系數(shù)的標(biāo)度
lncRNA基因與泛癌腫瘤免疫的相關(guān)性分析
接下來分析了TSPOAP1-AS1和MIR600HG的表達(dá)與33個腫瘤的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞水平的關(guān)系。TSPOAP1-AS1 在 KICH、LUAD 和 STAD中與免疫細(xì)胞含量和基質(zhì)細(xì)胞含量呈統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著正相關(guān)。TSPOAP1-AS1在BLCA、HNSC、KIRC、LUSC、MESO、SKCM和TGCT中與免疫細(xì)胞含量呈顯著正相關(guān)，而在UVM中僅與基質(zhì)細(xì)胞呈正相關(guān)。MIR600HG與KICH、LGG和SARC中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞含量顯著相關(guān)，但僅與TGCT中的免疫細(xì)胞顯著相關(guān)（圖6A）。
圖 6. 泛癌靶基因與腫瘤免疫的相關(guān)性分析： (A)TSPOAP1-AS1、MIR600HG與泛癌免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞含量的相關(guān)性
TSPOAP1-AS1的表達(dá)與7種癌癥中10種免疫細(xì)胞浸潤率顯著相關(guān)。例如在ESCA中，如圖，TSPOAP1-AS1與幼稚B細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān)。
TSPOAP1-AS1與PAAD中記憶B細(xì)胞的含量也呈顯著負(fù)相關(guān)，而MIR600HG的表達(dá)與DLBC、LAML、PAAD中初始B細(xì)胞的含量呈顯著負(fù)相關(guān)并且與 LAML 中單核細(xì)胞的含量顯著正相關(guān) (圖 6B)。
圖 6 ：(B)TSPOAP1-AS1、MIR600HG的表達(dá)與多種腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性
TSPOAP1-AS1在23種腫瘤中均存在與其中度相關(guān)的免疫基因。TSPOAP1-AS1在15種癌癥中與免疫基因BTLA呈顯著相關(guān)，與PAAD和CHOL相關(guān)性強(qiáng)，其他主要顯著免疫基因包括CD28和 CD40LG（圖 6C）。
圖 6 ：(C) TSPOAP1-AS1、MIR600HG 和免疫基因在 33 個腫瘤中的共表達(dá)結(jié)果，藍(lán)色代表 P 值，紅色代表相關(guān)系數(shù)
MIR600HG 僅在 8 種腫瘤（CHOL、DLBC、GBD、LAML、LGG、PAAD、SARC 和 THYM）中與幾種免疫基因顯著相關(guān)；與 TSPOAP1-AS1 相比，該 lncRNA 與較少的免疫基因相關(guān)，且相關(guān)程度較低。
研究結(jié)論
lncRNAs在腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用，不僅是癌癥預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，也是泛癌水平的分子特征。由于胰腺癌的預(yù)后較差，準(zhǔn)確評估預(yù)后是制定胰腺癌治療方案的關(guān)鍵。在這里，作者使用 Cox 回歸和 lasso 回歸分析了來自TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的胰腺癌數(shù)據(jù)，并使用兩個數(shù)據(jù)庫的組合以及僅TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。構(gòu)建了與胰腺癌生存率顯著相關(guān)的預(yù)后風(fēng)險評分模型，并研究了兩種lncRNA。使用這兩種 lncRNA 對 33 種癌癥的分析表明，TSPOAP1-AS1 是 7 種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物，其中胰腺癌最為顯著，MI600HG 是卵巢癌和胰腺癌的預(yù)后標(biāo)志物。TSPOAP1-AS1 與某些癌癥的臨床分期和腫瘤突變負(fù)荷以及許多癌癥的免疫浸潤強(qiáng)烈相關(guān)，而在多種癌癥中觀察到MI600HG與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。此研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解lncRNAs在癌癥中的不同功能，并可能有助于lncRNAs作為癌癥預(yù)后因素的臨床應(yīng)用。
