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各位小伙伴大家好呀，今天小編給大家?guī)?lái)今年1月份發(fā)表在Nature communications(IF=17.694)上的一篇關(guān)于T細(xì)胞耗竭的研究，z作者繪制了詳細(xì)的乳腺癌T細(xì)胞耗竭相關(guān)的免疫微環(huán)境圖譜，生物學(xué)知識(shí)豐富，快來(lái)一起學(xué)習(xí)一下吧！
一.研究背景
免疫檢查點(diǎn)阻斷療法改善了許多癌癥患者的預(yù)后，在乳腺癌中的應(yīng)用仍然局限于三陰性患者，且大多數(shù)患者不能獲得長(zhǎng)期的臨床獲益。以前認(rèn)為是由于免疫原性差，但一些研究已經(jīng)確定了免疫浸潤(rùn)對(duì)乳腺癌進(jìn)展的強(qiáng)烈影響。在靶細(xì)胞清除失敗且T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)持續(xù)存在的慢性炎癥部位，T細(xì)胞可能變得“耗竭”，這是一種以抑制性檢查點(diǎn)受體(如PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3)共表達(dá)升高為特征的細(xì)胞狀態(tài)；但最近的研究表明，耗竭性T細(xì)胞仍可能在人類腫瘤中增殖，但這些細(xì)胞在多大程度上保留其抗腫瘤功能尚不清楚。于是作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)(scRNA-seq)結(jié)合成像質(zhì)譜流式(IMC)分析系統(tǒng)地研究了含有或不含有耗竭T細(xì)胞的人類乳腺腫瘤的免疫環(huán)境，重點(diǎn)關(guān)注了管腔(luminal)亞型。描述了衰竭相關(guān)的腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)特征，這有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，并提出PD-1、CXCL13和MHC-I作為患者分層的新biomarker組合。
二.主要結(jié)果
1.乳腺腫瘤免疫環(huán)境的單細(xì)胞圖譜
為了系統(tǒng)地研究乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)，作者對(duì)14例免疫浸潤(rùn)性乳腺腫瘤進(jìn)行了scRNA-seq(圖1a)?；谧髡咧暗难芯?，根據(jù)腫瘤和免疫細(xì)胞的共同模式對(duì)腫瘤患者進(jìn)行了分組，作者發(fā)現(xiàn)一半的樣本含有耗竭T細(xì)胞(例如PD-1high/CTLA-4high/CD38highT cells)，于是將其稱為耗竭環(huán)境(IE1)；另一半主要含有不表達(dá)衰竭標(biāo)記的T細(xì)胞，稱為非耗竭環(huán)境(IE2)。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制，作者保留了119000個(gè)高質(zhì)量的細(xì)胞(圖1b、c)，基于已知的marker基因表達(dá)情況，手動(dòng)注釋了主要的細(xì)胞類型(圖1d、e)。作者觀察到IE1和IE2腫瘤的主要細(xì)胞類型在頻率上沒(méi)有顯著差異(圖1f)，盡管不同的T細(xì)胞表型導(dǎo)致了IE1和IE2之間的區(qū)別，但兩組的整體T細(xì)胞頻率是相似的。
為了驗(yàn)證基于scRNA-seq數(shù)據(jù)的發(fā)現(xiàn)，作者對(duì)14個(gè)測(cè)序樣本保留的12個(gè)FFPE樣本進(jìn)行了IMC分析。對(duì)每一個(gè)panel分析共獲得了77個(gè)感興趣區(qū)域(ROIs)(圖1g)，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理和細(xì)胞分割，每個(gè)panel有超過(guò)40萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞，對(duì)于細(xì)胞數(shù)量相似的連續(xù)切片，作者手動(dòng)匹配了ROI，并且根據(jù)平均marker表達(dá)進(jìn)行了基于圖聚類，識(shí)別了存在的細(xì)胞類型(圖1h)；除在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中鑒定的所有細(xì)胞類型外，作者在IMC數(shù)據(jù)中還鑒定到了中性粒細(xì)胞，但中性粒細(xì)胞通常很少，且在IE1樣本中出現(xiàn)的頻率略高于IE2樣本。
2. PD-1high/CTLA-4high T細(xì)胞具有增殖能力，表達(dá)腫瘤反應(yīng)性標(biāo)志物，并與腫瘤細(xì)胞中MHC-I的高表達(dá)相一致
為了進(jìn)一步探究這些腫瘤中T細(xì)胞的功能狀態(tài)，作者分析了各個(gè)T細(xì)胞亞型的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并且加入了NK細(xì)胞，因?yàn)槠渑cT細(xì)胞具有轉(zhuǎn)錄和功能相似性，據(jù)報(bào)道也可能發(fā)生耗竭。作者首先使用偽bulk(pseudobulk)的方法進(jìn)行分析，如圖2a所示，IE1中PDCD1、CD276和分別編碼免疫檢查點(diǎn)受體PD-1、B7-H3和TIM-3的HAVCR2表達(dá)水平高于IE2，這與之前的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果一致；如MKI67、GZMB等與T細(xì)胞激活相關(guān)的基因IE1的表達(dá)水平也高于IE2。此外，編碼三種轉(zhuǎn)錄因子(IRF4,BATF4和TOX)的mRNA表達(dá)水平在IE1的T和NK細(xì)胞中也明顯高于IE2(圖2b)，這與TCR信號(hào)通路的強(qiáng)弱相關(guān)。最后，作者發(fā)現(xiàn)IE1的T細(xì)胞和NK細(xì)胞中細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的表達(dá)普遍高于IE2，其中CCL3、CXCR6、CSF1和IL13的差異最為顯著，這些細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體都在炎癥信號(hào)傳導(dǎo)中起作用(圖2c)。
為了比較在IE1和IE2免疫環(huán)境中T和NK細(xì)胞表型的組成，并確定哪些細(xì)胞類型具有豐度變化，作者對(duì)上兩種細(xì)胞類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了重聚類并注釋了細(xì)胞亞型(圖2d-f)。高表達(dá)衰竭標(biāo)志物CD8+耗竭T細(xì)胞簇、兩個(gè)高表達(dá)PDCD1的CD4high細(xì)胞簇，已知的T濾泡輔助(Tfh)、一個(gè)NKT細(xì)胞簇在IE1中富集(圖2e、f)，毒性細(xì)胞簇在IE2微環(huán)境中富集。
接下來(lái)，作者更詳細(xì)地探討了衰竭相關(guān)的表型T細(xì)胞狀態(tài)。有研究將T細(xì)胞耗竭狀態(tài)描述為一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，在此過(guò)程中，自我更新的祖細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子TCF7，然后隨著衰竭的增加和增殖潛力的降低而逐漸消失。作者觀察到IE1中TCF7 mRNA的表達(dá)減少(圖2b)，特別是在IE1富集的T-CD8耗盡的簇。與IE2相比，IE1環(huán)境也富含增殖T細(xì)胞(圖2e)。T增殖細(xì)胞簇在所有腫瘤反應(yīng)性和衰竭相關(guān)樣本中也富集，與非增殖細(xì)胞相比，TCF7的含量較低(圖2h)。這些結(jié)果表明表達(dá)衰竭特征的毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)也表達(dá)腫瘤反應(yīng)特征和增殖標(biāo)志物。
作者進(jìn)一步研究了IE1和IE2中CD8+T細(xì)胞激活差異的潛在來(lái)源。偽bulk分析顯示，與IE2的腫瘤相比，IE1的腫瘤上皮細(xì)胞中MHC-I編碼基因的表達(dá)顯著高于IE2的腫瘤，這在IMC分析中更為明顯(圖2i)。作者分析表明，MHC I類表達(dá)構(gòu)成了IE1和IE2腫瘤細(xì)胞之間的主要差異，MHC-I比PD-L1與CD8+T細(xì)胞活化更相關(guān)。作者在IMC分析中發(fā)現(xiàn)，CXCL13在IE1中的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上均得到證實(shí)(圖2j, k)，并且通過(guò)scRNA-seq和IMC檢測(cè)到的CXCL13+T細(xì)胞在同一腫瘤的兩個(gè)獨(dú)立片段上的比例高度相關(guān)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，在免疫環(huán)境衰竭的腫瘤中，T細(xì)胞具有增殖能力，顯示出腫瘤反應(yīng)特征，盡管有最終衰竭的跡象，但可能比免疫環(huán)境未衰竭的腫瘤中的T細(xì)胞保留更多的抗腫瘤活性。
3. 在衰竭的免疫環(huán)境中細(xì)胞毒性潛能被改變，但沒(méi)有消除
在這一部分，作者研究了兩種免疫環(huán)境在T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛能方面的差異。對(duì)IE1和IE2樣本中9個(gè)選定基因進(jìn)行偽bulk比較，結(jié)果顯示，在IE2 T細(xì)胞和NK細(xì)胞中唯一顯著升高的細(xì)胞毒性分子是TNF，而GZMB、GNLY和FASL在IE1中表達(dá)水平較高(圖3a)。GZMB和FASL在T-CD8耗竭的簇中表達(dá)最高(圖3b)，這表明盡管這些T細(xì)胞的表型是耗竭，但它們?nèi)跃哂邪l(fā)揮細(xì)胞溶解效應(yīng)功能的潛力。
為了進(jìn)一步評(píng)估IE1和IE2之間的細(xì)胞毒性潛能差異，作者對(duì)CD8+T細(xì)胞進(jìn)行了偽時(shí)序分析。結(jié)果顯示，一端是na?ve T細(xì)胞，另一端是耗盡的T細(xì)胞，中間是細(xì)胞毒性簇(圖3c、d)，且IE1樣本的平均偽時(shí)間分?jǐn)?shù)更高(圖3e)，支持免疫耗竭是一個(gè)連續(xù)統(tǒng)的概念。作者發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞毒性基因中，IFNG和TNF早期升高，其次是GZMB(圖3f)。
為了更好地理解NKT細(xì)胞如何作用于IE1環(huán)境，作者更詳細(xì)地分析了它們的表達(dá)譜。CSF1是NKT細(xì)胞簇中少數(shù)幾個(gè)獨(dú)特的過(guò)表達(dá)基因之一(圖3g)，它編碼一種對(duì)髓系細(xì)胞的活化和分化很重要的細(xì)胞因子。因此，T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的主要效應(yīng)物在兩種免疫環(huán)境中是不同的。NKT細(xì)胞在耗竭T細(xì)胞富集的免疫環(huán)境中表達(dá)CSF1可能代表了T細(xì)胞活性和髓細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)之間的聯(lián)系。
4. 免疫耗竭環(huán)境中的髓系細(xì)胞表明炎癥增加
于是在這一部分，作者分析了IE1和IE2中的髓系細(xì)胞亞群。對(duì)髓系細(xì)胞(單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，不包括粒細(xì)胞)的偽bulk分析(圖4a)顯示，IE1中幾個(gè)細(xì)胞因子的編碼mRNA過(guò)表達(dá)，最顯著的是CCL18，它之前被認(rèn)為與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。對(duì)髓系細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行重聚類共注釋出單核細(xì)胞(mono)或早期分化的巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)、樹(shù)突細(xì)胞(DCs)和增殖的髓系細(xì)胞(圖4b)，大多數(shù)單核細(xì)胞和TAM簇在IE1腫瘤中更常見(jiàn)(圖4c)，而IE2腫瘤顯示TAM-2簇和經(jīng)典2型DCs富集。mono-1細(xì)胞簇表現(xiàn)出單核細(xì)胞特異性的基因標(biāo)簽，而mono-2細(xì)胞簇表現(xiàn)出與多個(gè)TAM細(xì)胞簇重疊的模式，可能代表單核細(xì)胞向成熟巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變表型(圖4d)。
作者接下來(lái)研究了T細(xì)胞和髓系細(xì)胞間的相互作用關(guān)系。作者從文獻(xiàn)中收集到兩組基因signature定量分析了髓系細(xì)胞吸引T細(xì)胞和抑制T細(xì)胞的特性。兩個(gè)signature在單細(xì)胞水平、患者水平和表型簇水平均顯示出正相關(guān)(圖4e)，提示具有強(qiáng)抑制潛能的髓系細(xì)胞也可能主動(dòng)吸引T細(xì)胞。作者還觀察到DC中T細(xì)胞抑制的標(biāo)志物表達(dá)，與其他DC相比，migDC簇表現(xiàn)出特別強(qiáng)的T細(xì)胞抑制特征(圖4e)，具體體現(xiàn)在腫瘤組織中，migDC的PD-L1編碼蛋白CD274的表達(dá)水平最高；軌跡推斷分析(Slingshot)提示cDC2s向migDCs過(guò)渡，與之前的研究一致(圖4g)。作者還觀察到在cDC2-migDC的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，不同的migDC標(biāo)記物如CCL17,CCL22,CCL19的表達(dá)變化(圖4h)。綜上，有或無(wú)耗竭T細(xì)胞富集的免疫環(huán)境中存在炎癥狀態(tài)不同的髓系細(xì)胞。
5. 免疫狀態(tài)與不同的細(xì)胞間通訊模式有關(guān)
在這一部分，作者系統(tǒng)地研究了IE1和IE2免疫環(huán)境中的細(xì)胞相互作用差異。首先作者量化了所有樣本中每個(gè)細(xì)胞類型對(duì)的預(yù)測(cè)配體受體對(duì)(LR)相互作用的總數(shù)(圖5a)，揭示了許多預(yù)測(cè)的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，以及髓系細(xì)胞的自相互作用。
接下來(lái)，作者比較了有和無(wú)T細(xì)胞耗竭的乳腺腫瘤免疫環(huán)境中預(yù)測(cè)的相互作用，發(fā)現(xiàn)了大量富集于IE1或IE2腫瘤的預(yù)測(cè)LR對(duì)(圖5b)。為了研究特定的髓系細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞亞型之間如何相互作用，作者關(guān)注這些亞型的交互作用分析(圖5c)，為了更好的生物學(xué)解釋，作者首先將已識(shí)別的cluster聚合成更大的metacluster，每個(gè)metacluster代表一個(gè)特定的細(xì)胞亞型；結(jié)果顯示所有T細(xì)胞、NK細(xì)胞和髓系metacluster都有300到600個(gè)預(yù)測(cè)相互作用，其中TAM自相互作用最為頻繁。
然后，作者使用NicheNet預(yù)測(cè)哪些髓系衍生配體與T細(xì)胞耗竭聯(lián)系最密切。最能預(yù)測(cè)耗竭相關(guān)基因表達(dá)的髓系來(lái)源配體是IL15，其次是IL1B和CXCL16(圖5d)，這與IE1和IE2腫瘤中IL15-IL15受體相互作用的富集的結(jié)果一致。總之，作者預(yù)測(cè)了T細(xì)胞與其他細(xì)胞的相互作用，并且表明在耗竭型T細(xì)胞高的免疫環(huán)境中，細(xì)胞因子和趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，特別是髓系細(xì)胞與T和NK細(xì)胞。
6. 免疫細(xì)胞的空間分布隨耗竭而變化
LR分析可以預(yù)測(cè)細(xì)胞間的通信，但它對(duì)細(xì)胞空間的信息是盲目的。因此，作者使用IMC數(shù)據(jù)來(lái)研究預(yù)測(cè)的相互作用的細(xì)胞是否在空間上也是鄰近的，以及IE1和IE2的空間模式是否不同。作者使用成對(duì)鄰域分析來(lái)量化每個(gè)細(xì)胞類型對(duì)的相對(duì)排斥或相互作用，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在彼此的鄰域內(nèi)高度富集(圖6a)，與預(yù)測(cè)的LR相互作用相一致?？傮w而言，與PD-1低表達(dá)的T細(xì)胞相比，PD-1high T細(xì)胞至少有一個(gè)migDC作為其直接鄰近細(xì)胞(圖6b、c)。作者進(jìn)一步量化了不同T細(xì)胞亞型的近鄰的細(xì)胞類型組成，結(jié)果表明，與PD-1lowT細(xì)胞和Tregs相比，平均而言，PD-1highT細(xì)胞被較少的髓系細(xì)胞和成纖維細(xì)胞包圍，但被更多的其他PD-1highT細(xì)胞、pDC和migDCs包圍(圖6d)。
為了確定這些細(xì)胞因子周圍的細(xì)胞類型，作者定義了細(xì)胞因子周圍30μm范圍內(nèi)的所有細(xì)胞，并將這些細(xì)胞因子中的細(xì)胞類型與整個(gè)組織進(jìn)行了比較(圖6e)，作者發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞在CXCL9、CCL22和CXCL13環(huán)境下富集，而CD8+T細(xì)胞在CXCL9和CXCL10環(huán)境下富集最高；B細(xì)胞在CXCL13環(huán)境中顯著富集，migDC在CCL17和CCL22環(huán)境中顯著富集，而髓系細(xì)胞在CCL18環(huán)境中顯著富集(圖6f)。作者進(jìn)一步對(duì)原始樣本進(jìn)行了免疫熒光玻片掃描，該方法可以直接檢測(cè)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)，作者發(fā)現(xiàn)密集的成熟TLS在IE2分類的腫瘤中更常見(jiàn)，而不成熟TLS在IE1分類的腫瘤中更常見(jiàn)(圖6g)。雖然CXCL13+T細(xì)胞在TLS形成中也起作用，但CXCL13+T細(xì)胞的空間分布在包含成熟TLS和不成熟TLS的圖像之間發(fā)生了變化(圖6h)。
總之，空間分析與主要預(yù)測(cè)的細(xì)胞間相互作用一致，并揭示了細(xì)胞因子表達(dá)細(xì)胞的空間聚集在IE1腫瘤中頻繁出現(xiàn)。且migDC介導(dǎo)的T細(xì)胞活性調(diào)節(jié)是通過(guò)直接相互作用發(fā)生的，優(yōu)先發(fā)生在或接近成熟和不成熟TLS區(qū)域，并且CXCL13+T細(xì)胞在不同免疫環(huán)境的腫瘤中空間分布上存在差異。
至此這篇文章就介紹完啦，總結(jié)一下：作者首先將乳腺癌的腫瘤免疫微環(huán)境根據(jù)是否富集耗竭性T細(xì)胞分為了兩類；第二步詳細(xì)的研究了耗竭型和非耗竭型腫瘤中的T細(xì)胞功能差異，證明了免疫環(huán)境衰竭的腫瘤中，T細(xì)胞具有增殖能力，顯示出腫瘤反應(yīng)特征；第三步由于T細(xì)胞活性和髓細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)之間的存在聯(lián)系，作者對(duì)髓系細(xì)胞與T細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行了詳細(xì)的探討；最后，基于預(yù)測(cè)的配體受體對(duì)以及IMC的分析驗(yàn)證了作者的結(jié)論，即在耗竭型T細(xì)胞高的免疫環(huán)境中，細(xì)胞因子和趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，特別是髓系細(xì)胞與T和NK細(xì)胞。
這篇文章在小編看來(lái)有幾大兩點(diǎn)：第一是T細(xì)胞耗竭這個(gè)近年來(lái)的熱點(diǎn)分析；第二是配對(duì)的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)以及FFPE樣本的IMC分析及其具有說(shuō)服力；第三便是作者的寫(xiě)作，強(qiáng)烈建議大家去拜讀一下原文，完全可以當(dāng)做一本關(guān)于T細(xì)胞耗竭的生物書(shū)來(lái)看。T細(xì)胞耗竭這個(gè)熱點(diǎn)，屏幕前的你還不速速學(xué)起來(lái)，下一篇NC就是你哦！
