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大家好，今天給大家分享的文獻是2022年4月份發(fā)表在Cell Genomics上的文章。識別由疾病相關變異引起的細胞功能失調(diào)，可能意味著在細胞治療中發(fā)現(xiàn)藥物靶標或調(diào)節(jié)新途徑。本研究是第一次深入研究免疫疾病變異對Treg細胞基因表達調(diào)節(jié)和功能失調(diào)的影響。
Immune disease variants modulate gene expression in regulatory CD4+ T cells
在調(diào)節(jié)性CD4+ T細胞中免疫疾病變異調(diào)節(jié)基因表達
背景：通過全基因組關聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWASs）繪制的數(shù)千種疾病變異為疾病生物學提供了遺傳錨，但對GWAS信號的功能解釋一直具有挑戰(zhàn)性，因為絕大多數(shù)變異是非編碼的。一種將遺傳變異與下游效應聯(lián)系起來的方法包括表達數(shù)量性狀位點（expression quantitative trait locus，eQTL）作圖，其轉錄水平與遺傳多態(tài)性相關。然而，由于遺傳變異之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），已鑒定的eQTL通常導致數(shù)十到數(shù)百個相關變異與基因表達水平相關聯(lián)，因此無法確定致病調(diào)節(jié)變異。
通過使用染色質(zhì)可及性或組蛋白修飾（chromatin QTLs，chromQTLs）對染色質(zhì)活性進行QTL作圖，可以進一步推斷出基因表達變化背后確切調(diào)控變異的優(yōu)先級。在這種方法中，調(diào)節(jié)染色質(zhì)標記活性的變異與chromQTL物理重疊。eQTLs和chromQTLs的組合提供了一個強大工具包，用于將非編碼變異與表達基因聯(lián)系起來，用于確定功能變異的優(yōu)先級，并用于確定調(diào)節(jié)基因表達的機制。最后，疾病GWAS信號與eQTLs的共定位可以指向疾病關聯(lián)的致病基因和機制，因此可將疾病相關變異與失調(diào)途徑和新藥物靶點聯(lián)系起來。
與常見免疫介導疾病相關的GWAS變異，如炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）和類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA），均富含活性染色質(zhì)標記，這些可以標記CD4+ T（尤其是調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg細胞））中的增強子和啟動子。免疫表型研究表明，循環(huán)Treg細胞數(shù)量異常和Treg細胞抑制功能缺陷均導致免疫疾病患者以及器官和造血干細胞移植受者的免疫反應。總之，Treg細胞中基因表達失調(diào)的遺傳錨和指向這種細胞類型功能受損的免疫表型研究表明，確定遺傳變異調(diào)節(jié)Treg細胞功能的機制可能具有重要的臨床意義。盡管Treg細胞在維持免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用，但它們在循環(huán)血液中的低頻率導致可用基因組資源數(shù)量有限。因此，免疫疾病變異通常根據(jù)來自外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）、免疫細胞或分離出的主要免疫細胞群數(shù)據(jù)來解釋基因表達。但這些數(shù)據(jù)集可以稀釋或忽略僅存在于稀有細胞類型中的基因調(diào)控作用，因此可能會錯過對疾病有意義的生物效應。
在這里，為了能在與疾病生物學密切相關的細胞類型背景下解釋免疫疾病變異，作者生成了第一張從124名健康個體中分離出的Treg細胞基因表達調(diào)控圖譜。作者確定了10880個QTLs效應（3685個eQTLs和7195個chromQTLs）。與初始CD4 T細胞和單核細胞相比，作者在Treg細胞中檢測到21%的eQTLs和29%的活性增強子和啟動子QTLs。通過將Treg QTLs與14種不同免疫疾病相關變異共定位，作者在Treg細胞中鑒定了133個功能相關的GWAS基因座。免疫疾病GWAS信號與chromQTLs的重疊改善了68個免疫疾病位點上的相關變異。作者將Treg細胞eQTLs基因分配到81個免疫疾病位點。在52個位點中檢測到無法與下游基因靶點關聯(lián)的chromQTLs共定位，表明基因調(diào)控效應可以在特定細胞狀態(tài)下表現(xiàn)出來。最后，作者使用優(yōu)先級基因確定用于重新使用的藥物并定義驗證的新靶標。作者的研究提供了從免疫疾病相關變異，通過基因表達調(diào)控Treg細胞，到新的治療方案的轉化途徑。
方法：
RNA-seq、轉座酶可接近性染色質(zhì)測序（assay for transposase-accessible chromatin using
Sequencing，ATAC-seq）、H3K4me3和H3K27ac ChM-seq（ChIPmentation-seq）、
結果：
1.Treg細胞中基因表達調(diào)控的全面目錄
為了鑒定健康人分離的Treg細胞中基因表達調(diào)控的遺傳變異，作者使用RNA-seq分析了轉錄組（124人）、ATAC-seq分析了染色質(zhì)可及性（73人）、用H3K4me3分析啟動子（88人）和用H3K27ac分析活性增強子和啟動子區(qū)域（91人）（圖1A）。作者檢測到12517個基因表達，而染色質(zhì)分析顯示39134個可及性區(qū)域、39409個H3K4me3標記的啟動子區(qū)域和33910個H3K27ac標記的活性染色質(zhì)區(qū)域（圖1B）。用62個樣本，作者估計了由遺傳成分和染色質(zhì)調(diào)控特征解釋的基因表達變異百分比。作者觀察到驅動轉錄變異的主要成分是普通的遺傳變異。對于75%的eQTL基因，作者能解釋5%或更多的表達變異（圖1C）。接下來作者進行了QTL作圖以定義Treg細胞中受遺傳控制的基因和染色質(zhì)特征。作者檢測到3685個基因（29%）和125650個eQTL變異至少有一個獨立關聯(lián)（圖1B-1D）。作者使用染色質(zhì)可及性（caQTL，1450；4%）、H3K4me3（promQTL，1455；4%）和H3K27ac（actQTL，4290；13%）組蛋白標記，共繪制了7195個chromQTLs，對應于9292個非重疊峰值區(qū)，與152648個chromQTL變異相關。在H3K27ac特征中檢測到大多數(shù)chromQTLs（4290個actQTL；圖1B）。在所有分析中，基因變異（5761739）、439582（7%）處于峰值內(nèi)；然而，只有一小部分映射到染色質(zhì)特征中，并且還與chromQTLs（38507個SNPs；0.7%）、eQTLs（22217個SNPs；0.4%）或兩者（17815個SNPs；0.3%）相關聯(lián)（圖1D）。對于28%（1035）的所有eQTLs基因，作者觀察到至少一個eQTL變異是chromQTL，并且也位于染色質(zhì)峰中（圖1E），對于另外2020個eQTLs基因，作者能夠將一個eQTL變異與染色質(zhì)峰聯(lián)系起來，雖沒有檢測到染色質(zhì)特征上的QTL效應。這種重疊的一部分可能沒有功能，因為染色質(zhì)調(diào)控特征在整個基因組中都很豐富，因此偶然可能會重疊常見的遺傳變異。有趣的是，作者無法將大多數(shù)actQTL變異與eQTL聯(lián)系起來（圖1E），這意味著這些調(diào)控區(qū)域可能在特定的細胞環(huán)境下或通過多個調(diào)控元件的相互作用調(diào)節(jié)基因表達。
圖1 Treg細胞QTLs定位概述。（A）研究設計示意圖。（B）每個方法中每次基因組試驗定義的特征數(shù)和顯著QTLs數(shù)。（C）由遺傳變異和染色質(zhì)標記解釋的eQTL基因表達變異比例。（D）基因變異的功能分類。（E）eQTL基因分類（上）和actQTL峰分類（下）。
2.定義Treg細胞的基因表達調(diào)控
在確認了數(shù)據(jù)集捕獲了與Treg細胞生物學相關的效應后，作者接下來使用了BLUEPRINT項目中的CD4初始T細胞，因為它也分析了轉錄組和H3K27ac且研究對象類似。作者觀察到69%的eQTLs與初始CD4 T細胞共用（圖2A），且具有相似的效應大小和相同效應方向。在Treg細胞和初始T細胞之間觀察到eQTL效應的相關性高于Treg細胞和單核細胞之間的相關性，這也由pi1估計值證實（圖2B和2C）。盡管Treg細胞和其他兩個細胞類型之間的有大量eQTL共享，作者將775個基因分類為Treg細胞數(shù)據(jù)集特有的，其中包括92個在Treg細胞中表達的基因。在Treg細胞特異性eQTL中，有許多對免疫功能調(diào)節(jié)至關重要的基因，包括TNFRSF14，一種將淋巴細胞吸引到上皮細胞的趨化因子（圖2D）。作者比較Treg、初始T細胞和單核細胞中相同峰值區(qū)域的遺傳效應，觀察到1307個（29%）actQTLs是Treg細胞特異性的（圖2A）。盡管所有峰效應大小的一致性很小，但具有共享QTLs的峰表達了相似效應大小（圖2B）。pi1分析的結果也反映了作者從RNA中觀察到的Treg細胞QTLs在原始數(shù)據(jù)集中的復制率高于單核細胞（圖2C）。在Treg細胞特異性actQTL效應中，作者觀察到FCRL3基因啟動子的一個峰值是Treg細胞抑制功能的潛在負調(diào)節(jié)因子（圖2E）。
圖2 在調(diào)節(jié)性T細胞、CD4+初始細胞和單核細胞中鑒定的eQTLs和actQTLs比較。（A）Treg細胞的eQTLs和actQTLs與初始T細胞和單核細胞的比例比較。（B）三種細胞類型之間eQTLs和actQTLs的成對pi1得分。（C）所有eQTLs和actQTLs的相同基因或峰的回歸斜率和變異對之間的Spearman相關性（彩色），以及和共享對之間的Spearman相關性（灰色）。（D和E）Treg細胞特異性（D）eQTL和（E）actQTL的例子。
3.Treg細胞QTLs與免疫疾病位點共定位
為了將疾病相關位點精細定位到致病基因和變異中，作者接下來將Treg細胞QTL結果與來自常見免疫疾病的GWAS信號相結合，應用貝葉斯框架來測試疾病相關變異和Treg細胞QTL信號共定位。作者測試了14種免疫疾病相關的1290個獨特的GWAS基因座：過敏性疾?。╝llergic diseases，ALL）、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）、哮喘（asthma，AST）、乳糜瀉（celiac disease，CEL）、克羅恩病（Crohn’s disease，CD）、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、銀屑?。╬soriasis，PS）、類風濕性關節(jié)炎（psoriasis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）、潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和白癜風（vitiligo，VIT）。共定位數(shù)量最多的疾病（超過20個共定位信號）包括IBD、UC、CD、ALL、T1D、VIT和PBC（圖3A）。作者觀察到疾病基因座和至少一個Treg細胞QTL之間有360個明顯共定位，對應133個獨特GWAS基因座（圖3B）。將共定位基因座分為三類：第1層基因座包含GWAS關聯(lián)與eQTL和染色質(zhì)QTL共定位的31個信號。第2層基因座包含50個信號，只觀察到eQTL共定位。第3層中52個位點包括與染色質(zhì)QTL共定位的GWAS信號，但不包括eQTL，第3層位點代表了大多數(shù)共定位。接下來，作者評估了那些已識別的eQTL與特異性調(diào)控Treg細胞基因表達的免疫疾病變異體共定位，，而不是初始T細胞或單核細胞。在81個與Treg細胞eQTL共定位的GWAS位點中，31個為Treg細胞特異性位點，且它們不存在于初始T細胞或單核細胞中（圖3C）。
圖3 免疫疾病GWAS位點與Treg細胞QTLs的共定位。（A）Treg細胞eQTLs和染色質(zhì)QTLs與不同免疫疾病GWAS位點共定位的分布。（B）GWAS位點與不同類型Treg細胞QTLs共定位的分布。（C）與單核細胞、初始T細胞、Treg細胞eQTLs和actQTLs共定位的免疫GWAS位點數(shù)量。
4.共定位Treg細胞QTLs優(yōu)先考慮免疫疾病的致病變異和基因
使用與染色質(zhì)QTL峰重疊的第1層和第3層基因座，作者將68個GWAS基因座的信號從中位數(shù)48個相關變異細化為每個位點6個功能變異基因座（圖4A）。在68個基因座中，BACH2、CD28、CENPW、HERC2、JAZF1、MAP3K8、PIM3、RERE、STAT5A和THBS3基因座與eQTLs共定位并被精煉為單一功能變異（圖4B）。Treg細胞專有共定位以及Treg細胞actQTL特異性共定位表明Treg細胞生物學特征的通路調(diào)控。因此，作者更詳細地研究了帶IBD GWAS信號的Treg細胞專有共定位，由chr10:30,401,447（rs10826797）變異標記，該變異與actQTL共定位，在MAP3K8的TSS處調(diào)節(jié)一個6 kb大的H3K27ac峰和一個MAP3K8基因的eQTL（圖4C）。此外，作者觀察到與過敏相關的基因座與STAT5A eQTL以及80 kb actQTL共定位。該峰與STAT5A TSS重疊。近一半過敏變異LD與受調(diào)控的actQTL峰重疊，其中一個變異chr17:42,266,938（rs34129849）也映射到STAT5B基因內(nèi)含子處629-bp開放染色質(zhì)區(qū)（chr17: 42,266,595– 42,267,224）（圖4D）。
圖4 與Treg細胞QTLs共定位的免疫疾病關聯(lián)功能細化。（A）在x軸上LD中的SNPs數(shù)量，映射到y(tǒng)軸的chromQTL的SNPs數(shù)量達到峰值。（B）在LD中映射到chromQTL內(nèi)部的SNPs數(shù)量在x軸上達到峰值，同時映射到y(tǒng)軸的chromQTL和ATAC的SNP數(shù)量也達到峰值。（C和D）從上到下顯示基因注釋軌跡；ATAC-seq、H3K27ac和H3K4me3 ChM-seq的染色質(zhì)景觀；疾病區(qū)域關聯(lián)圖；eQTL和actQTL關聯(lián)p值，主要集中在被純合子基因型分層的H3K27ac圖譜中；被eQTL和actQTL分層的基因型小提琴圖。（C）顯示了與MAP3K8 eQTL和由chr10:30,401,447（rs10826797）標記的IBD共定位基因座。（D）顯示了由chr17:42,262,844（rs7207591）標記的與STAT5A eQTL和chr17:42,219,755 42,299,818 actQTL共定位的過敏相關的基因座。
5.Treg細胞QTLs闡明了CD28共刺激、腫瘤壞死因子和IL-10信號通路的藥物靶向作用
盡管GWAS在繪制疾病風險變異方面取得了成功，但將這些發(fā)現(xiàn)轉化為藥物靶點一直具有挑戰(zhàn)性。因此，作者使用Open Targets Platform系統(tǒng)地評估與免疫疾病信號共定位的eQTLs是否能夠識別已知和潛在的新藥靶點。在與免疫疾病共定位并在Open Targets Platform測試的91個eQTL基因中，發(fā)現(xiàn)了9個（第1層：BLK、CD28、PIM3、PTGIR和TNFRSF9，第2層：ERAP2、NDUFS1、TNFRSF1A和TYK2；圖5A）已成為已知藥物的靶標并用于臨床或正在進行臨床試驗。其中7個eQTL基因可以考慮用于藥物再利用：ERAP2、NDUFS1、PIM3、PTGIR、TNFRSF1A、TNFRSF9和TYK2，其中三個是Treg細胞特異性eQTLs。作者還觀察到63個基因尚不屬于臨床治療的一部分，但具有藥物治療的證據(jù)，其中47個被歸為高成藥性（其中8個是Treg細胞特異性的；圖5A）。作者使用Open Target定義成藥性，它基于蛋白質(zhì)中可用于小分子結合位點的可用性，抗體治療中可接近的抗原表位的存在，或一種化合物在臨床試驗中具有不同于小分子或抗體形態(tài)的報告。作者觀察到具有易處理特點的基因分為三個途徑：CD28家族共刺激、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號傳導和IL-10信號傳導（圖5B）。這些途徑在Treg細胞活化、增殖和存活以及抑制效應T細胞中起重要作用。
圖5 免疫疾病與Treg細胞QTLs的共定位決定藥物靶點。（A）1層和2層位點與免疫疾病具有藥物易處理性的GWAS變異共定位。（B）在CD28共刺激、TNF和抗炎IL-10通路中，具有易處理潛力的1層和2層基因。
結論：
1.文章構建了來自124人的CD4+ Treg細胞中基因表達和染色質(zhì)活性的數(shù)據(jù)集。
2.構建了3685個基因和7195個染色質(zhì)區(qū)數(shù)量性狀位點QTL圖譜。
3.Treg細胞QTLs和免疫疾病GWAS變異的共定位可以發(fā)現(xiàn)藥物靶點。
參考文獻：Bossini-Castillo L, Glinos D A, Kunowska N, et al. Immune disease variants modulate gene expression in regulatory CD4+ T cells[J]. Cell Genomics. 2022,2(4):100117.
