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大家好呀，今天讓我們來看一篇如何通過整合bulk數(shù)據(jù)和single-cell數(shù)據(jù)來解釋肝癌的腫瘤異質(zhì)性及其免疫抑制機(jī)制，文章于今年六月發(fā)表在《Molecular Oncology》（IF = 7.449）上，讓我們來一起學(xué)習(xí)一下吧！
肝細(xì)胞癌 (HCC) 是最常見的原發(fā)性肝癌。由于腫瘤異質(zhì)性，肝癌治療中出現(xiàn)耐藥性是不可避免的。為了提高免疫治療的療效，我們應(yīng)進(jìn)一步研究不同亞型患者免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，并確定合適的患者進(jìn)行特異性免疫治療。研究腫瘤抑制的機(jī)制，從而豐富免疫治療的療效。近年來，單細(xì)胞RNA測(cè)序 (scRNA-seq) 已成為揭示腫瘤免疫微環(huán)境中細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。在這項(xiàng)研究中，作者整合了scRNA-seq和多組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，揭示了肝癌的腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性及其免疫抑制機(jī)制。該發(fā)現(xiàn)有助于臨床診斷，豐富肝癌免疫治療。
作者首先通過NMF聚類方法將患者分為的三個(gè)亞型，并分析其腫瘤間異質(zhì)性，包括免疫浸潤(rùn)狀態(tài)和突變譜。將S1亞型定義為具有高免疫浸潤(rùn)評(píng)分的 “hot tumors”，將S2定義為具有高腫瘤純度評(píng)分的 “cold tumors”，將S3定義為具有高水平免疫抑制評(píng)分的 “immunosuppressed tumors”。
然后，作者使用來自三種HCC亞型的差異基因?qū)⒋罅縍NA數(shù)據(jù)與scRNA-seq數(shù)據(jù)整合構(gòu)建了一個(gè)基于108個(gè)基因的基因分類器。scRNA-seq樣品也可以使用108基因分類器被分成相應(yīng)的HCC亞型 (S1-CS1、S2-CS2、S3-CS3)。
隨后，三種亞型的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性被研究。值得注意的是，由于亞型三具有最差的預(yù)后，作者分析其免疫抑制的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BATF可以促進(jìn)CTLA4和TIGIT等免疫抑制基因的表達(dá)水平，并且在BATF敲除細(xì)胞系數(shù)據(jù)和其他兩個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中對(duì)BATF進(jìn)行了驗(yàn)證，證明了BATF可以促進(jìn)免疫抑制基因并誘導(dǎo)HCC的不良臨床預(yù)后。
1、使用非負(fù)矩陣分解（NMF）方法確定了HCC中存在三個(gè)子類型
對(duì)來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的353例轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用非負(fù)矩陣分解（NMF）算法的共識(shí)聚類確定了3個(gè)不同亞型（如圖1B），其中模式S1聚類120例，S2聚類144例，S3聚類89例。并在ICGC隊(duì)列中驗(yàn)證了聚類結(jié)果。有趣的是，發(fā)現(xiàn)S3患者在三種亞型中預(yù)后最差。同時(shí)，三種亞型的臨床指標(biāo)差異分析顯示S3患者的腫瘤分期明顯升高，這可能是該亞型預(yù)后不良的部分原因。
2、HCC的腫瘤間微環(huán)境(TME)異質(zhì)性分析
作者利用ESTIMATE算法評(píng)估三個(gè)亞型免疫浸潤(rùn)和腫瘤純度的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)S2的免疫評(píng)分低，但是腫瘤純度高（圖2A）；并通過CIBERSORT計(jì)算三個(gè)亞型22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例，發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞型之間浸潤(rùn)的活化免疫細(xì)胞存在差異（圖2B）。通過對(duì)三個(gè)亞型免疫細(xì)胞抑制基因評(píng)分的比較發(fā)現(xiàn)S3免疫抑制基因高表達(dá)，比較亞型T細(xì)胞的標(biāo)記基因（圖2C）、免疫抑制評(píng)分和生存預(yù)后結(jié)果，免疫抑制T細(xì)胞基因高評(píng)分可能和不良預(yù)后相關(guān)。 還通過GSVA對(duì)三種亞型進(jìn)行GO_BP和HALLMARKER進(jìn)行富集分析來研究亞型之間的功能特征，結(jié)果顯示，免疫相關(guān)通路（如IL6-STAT3和T cell selection）在S1和S3中富集，而CD4激活、炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞分化通路在S1中富集。此外，與S2中脂肪酸、脂質(zhì)代謝和氧化磷酸化水平相比，S3中B細(xì)胞凋亡和WNT通路的富集分?jǐn)?shù)更高（圖2D）。綜上所述，S2具有較低的免疫浸潤(rùn)率，顯示“cold tumors”特征，S1具有“hot tumors”特征，而S3具有高表達(dá)的免疫抑制基因特征，顯示“immunosuppressed tumors”特征。
為了研究突變和腫瘤免疫相關(guān)性，本文分析了HCC亞型之間的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)變異（CNV）的頻率差異以及不同亞型的特異性突變特征。具體來說，S2的鈣粘蛋白相關(guān)蛋白beta 1（CTNNB1）和ARID1A突變頻率顯著高于S1和S3。與S1和S2相比，S3中TP53和BAP1的突變頻率更高。BAP1調(diào)控細(xì)胞死亡和線粒體代謝，這與S3中耗竭標(biāo)記基因的高表達(dá)水平相一致(圖3A)。三種亞型的CNV譜均存在顯著的異質(zhì)性。S1擴(kuò)增的變異樣本最多，而S2缺失的變異樣本最多（圖3B）。S1、S2和S3三個(gè)亞型CNV突變區(qū)域也存在差異（圖3C）。根據(jù)每個(gè)亞型之間基因表達(dá)、缺失和擴(kuò)增得出以下結(jié)論，BAP1的高突變、YEATS4和VIMP的擴(kuò)增以及CYFIP2和ABLIM3的缺失可能誘導(dǎo)S3的免疫抑制環(huán)境，而CTNNB1的高突變可能抑制S2的免疫浸潤(rùn)。
3、一種通過整合bulk和single-cell轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的新型基因分類器
為了整合scRNA-seq數(shù)據(jù)和bulk數(shù)據(jù)，作者將GSE149614 scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的10個(gè)樣本根據(jù)基因平均表達(dá)值整合成bulk數(shù)據(jù)。使用免疫浸潤(rùn)和腫瘤純度估計(jì)計(jì)算免疫抑制、活化T細(xì)胞（aT）和liver scores。同時(shí)，評(píng)估了10個(gè)樣本的免疫和腫瘤純度評(píng)分。根據(jù)算得的評(píng)分將10個(gè)樣本分類：HCC02T、HCC03T、HCC04T和HCC05T為“cold tumor”（圖4A）；HCC08T、HCC09T和HCC10T“immunosuppressed tumor”（圖4B）；HCC01T、HCC06T和HCC07T為“hot tumor”（圖4C）。接下來，作者通過選擇與亞型相關(guān)的基因建立分類器識(shí)別上述參考集中的所有陽(yáng)性樣本。使用從三個(gè)亞型（S1、S2和S3）的差異表達(dá)基因?qū)⒖技M(jìn)行了分類分析，結(jié)果顯示，當(dāng)選擇前108個(gè)基因構(gòu)建分類器時(shí)，所有假陽(yáng)性率（FPRs）均為0且所有真陽(yáng)性率（TPRs）均為1（圖4d）。總而言之，這108個(gè)基因作為特征可以很好地將樣本分成我們預(yù)期的三個(gè)亞型。
4、三個(gè)HCC亞型之間的TME異質(zhì)性
作者對(duì)三個(gè)單細(xì)胞亞型（CS1,CS2,CS3）在細(xì)胞水平上進(jìn)行腫瘤微環(huán)境（TME）異質(zhì)性評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS3的免疫和免疫抑制評(píng)分最高，CS2的腫瘤純度和liver score最高（圖5A）。根據(jù)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)記基因進(jìn)行基因表達(dá)歸一化、降維、聚類和表征，將這些細(xì)胞分為16種類型，通過marker gene進(jìn)行注釋（圖5B,C）。然后，使用基因集變異分析（GSVA）的免疫基因集對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行分類。在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中，mT是一種（高表達(dá)IL7R、CCR7和CD69）記憶T細(xì)胞，在幼稚T或mT信號(hào)中富集。tT是一種（高表達(dá)HAVCR2、TIGIT、BATF和CTLA4）免疫抑制T細(xì)胞類型 (圖5D，E)。總而言之，在三個(gè)單細(xì)胞亞型中免疫細(xì)胞的占比結(jié)果顯示，CS1亞型NK和aT細(xì)胞占比多，CS3亞型mT、mB、tT、mMφ、myCAF細(xì)胞占比多，CS3亞型上皮細(xì)胞（H1、H2、H3、H4）細(xì)胞占比多，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因分類器的分類效果（圖5F）。
5、轉(zhuǎn)錄因子BATF以及MDSC樣巨噬細(xì)胞可促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的形成
由于CS3（single-cell）和S3（TCGA）兩個(gè)亞型都有著相似的免疫抑制的調(diào)控機(jī)制，所以本文分析促進(jìn)該亞型中免疫抑制T細(xì)胞形成的調(diào)節(jié)機(jī)制和細(xì)胞間的相互作用。首先，本文利用WGCNA計(jì)算CS3特異性亞型（mT、tT、myCAF和mMφ）相關(guān)的基因模塊（圖6A），得到12個(gè)顯著相關(guān)的基因模塊。每個(gè)模塊的關(guān)鍵基因構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，mT hub基因在T細(xì)胞選擇和T細(xì)胞分化途徑中富集，而tT hub基因負(fù)調(diào)控T細(xì)胞活化以及白細(xì)胞介素10的分泌（圖6B）。然后，將WGCNA與SCENIC計(jì)算的TF結(jié)果結(jié)合，選擇tT hub基因和TF調(diào)控顯著的結(jié)果，從而挖掘關(guān)鍵的免疫抑制促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄因子（TF）。值得注意的是：轉(zhuǎn)錄因子BATF可以調(diào)控TIGIT、CTLA4和共刺激基因ICOS（圖6C）。進(jìn)一步的驗(yàn)證也證明了這些基因?qū)χg存在明顯的共存現(xiàn)象（圖6D）。并發(fā)現(xiàn)BATF的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（圖6E），將Treg細(xì)胞上BATF敲除的GSE149197基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示，BATF、CTLA4、TIGIT和FOXP3的表達(dá)顯著降低（圖6F），這說明轉(zhuǎn)錄因子BATF可以通過上調(diào)免疫抑制基因的表達(dá)，在免疫抑制細(xì)胞的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
由于S3亞型具有較高的基質(zhì)得分，作者分析了腫瘤微環(huán)境細(xì)胞在腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成中的作用。細(xì)胞相互作用結(jié)果顯示，tT中的細(xì)胞可以通過趨化因子CXCL12_CXCR4、CCL4_CCR5和CCL3_CCR1與CS3特異性的mMφ相互作用。mMφ的特征是過表達(dá)免疫抑制基因IL10，并可以通過NECTIN2_TIGIT與tT相互作用。tT可以進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，最終促進(jìn)HCC中免疫抑制環(huán)境的產(chǎn)生。此外，mMφ通過CXCL12_CXCR4和生長(zhǎng)因子VEGFA_FLT1等趨化因子與myCAF和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用（圖6G）。同時(shí)，endothelial (End)中的內(nèi)皮細(xì)胞也可以通過TIGIT_PVR與tT相互作用，這也可能促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的形成。因此，mMφ可以直接或間接地促進(jìn)HCC的S3樣亞型的免疫抑制狀態(tài)。
作者通過對(duì)HCC bulk數(shù)據(jù)聚類分析，識(shí)別出三個(gè)亞型（S1，S2，S3），并且通過免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分、生存率、CNV對(duì)三個(gè)亞型進(jìn)行了異質(zhì)性分析并得出了很好的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)免疫抑制亞型S3和不良預(yù)后相關(guān)。接下來對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)取均值模擬bulk數(shù)據(jù)，使用bulk數(shù)據(jù)構(gòu)建的將HCC的single-cell數(shù)據(jù)分成CS1、CS2和CS3三個(gè)亞型，憑借這樣的方法將bulk數(shù)據(jù)和single-cell數(shù)據(jù)很好的結(jié)合在一起，發(fā)現(xiàn)了TF BATF可以通過上調(diào)免疫抑制基因的表達(dá)，在免疫抑制細(xì)胞的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并通過細(xì)胞之間的互作發(fā)現(xiàn)了S3腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成的原因。我們可以從本文中學(xué)習(xí)到亞型分析的常規(guī)方法以及如何連接bulk數(shù)據(jù)、single-cell數(shù)據(jù)。隨著single-cell技術(shù)迅速的發(fā)展，它可以讓我們對(duì)疾病在細(xì)胞有更好的解析，但是bulk數(shù)據(jù)常常具有更大的樣本量、包含更多的表型信息，所以將單細(xì)胞數(shù)據(jù)和bulk數(shù)據(jù)結(jié)合分析亞型也是很值得我們學(xué)習(xí)的。
參考文獻(xiàn)：
Wang T, Dang N, Tang G, Li Z, Li X, Shi B, Xu Z, Li L, Yang X, Xu C, Ye K. Integrating bulk and single-cell RNA sequencing reveals cellular heterogeneity and immune infiltration in hepatocellular carcinoma. Mol Oncol. 2022 Jun;16(11):2195-2213. doi: 10.1002/1878-0261.13190 . Epub 2022 Mar 1. PMID: 35124891 ; PMCID: PMC9168757 .
