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癌癥免疫治療的目的是激活抗原特異性T細(xì)胞，以促進(jìn)其抗腫瘤活性。例如，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的阻斷療法改善了很多實(shí)體瘤如肺癌、腎癌等患者的預(yù)后。但是實(shí)際上，已有文獻(xiàn)報(bào)道并不是所有的T細(xì)胞群體都會(huì)被免疫檢查點(diǎn)抑制劑激活，只有一小部分T細(xì)胞對(duì)PD1/PD-L1抑制劑敏感。今天給大家分享一篇2022年4月12日發(fā)表在Cancer Cell（IF:31.743）上，前體組織駐留記憶T細(xì)胞控制卵巢癌的免疫原性的文章。接下來(lái)讓我們一起看看這一小部分前體組織駐留記憶T細(xì)胞具有怎樣特異的功能以及怎樣調(diào)控卵巢癌的免疫原性的呢？

Ovarian cancer immunogenicity is governed by a narrow subset of progenitor tissue-resident memory T cells

前體組織駐留記憶T細(xì)胞控制卵巢癌的免疫原性

一．研究背景

癌癥免疫治療的目標(biāo)是重新激活抗原特異性T細(xì)胞，以促進(jìn)其抗腫瘤活性。而腫瘤使得了活化以及未活化的T細(xì)胞呈現(xiàn)出代謝障礙，免疫檢查點(diǎn)抑制劑阻斷治療改變了多種實(shí)體腫瘤的預(yù)后。在腫瘤抗原刺激下，許多腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞作為組織駐留記憶（TRM）樣T細(xì)胞在周?chē)M織中長(zhǎng)期駐留。在瘤床上，表達(dá)TCF1的干細(xì)胞樣CD8⁺ T細(xì)胞，是一種TIM3 ^- IL7R ⁺CD8⁺ T細(xì)胞，與PD1⁺ TIM3⁺ CD8⁺ T耗竭型細(xì)胞共存。T細(xì)胞受體（TCR）在干細(xì)胞樣和終末分化T細(xì)胞中具有顯著重疊部分，這說(shuō)明干細(xì)胞樣腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）可以逐步分化成終末耗竭的TILs。由于TRM樣CD8⁺ T細(xì)胞通常缺乏淋巴結(jié)歸位受體CCR7，TRM樣TILs和干細(xì)胞樣TILs仍是屬于不同的群體。在卵巢癌中，免疫檢查點(diǎn)阻斷治療未能很好地改善患者的預(yù)后，這引起了研究人員對(duì)卵巢癌免疫原性的質(zhì)疑。因此，本研究確定了卵巢癌患者中的TILs可以特異性識(shí)別腫瘤抗原，并且起到主要作用的是一小群具有干細(xì)胞樣TRM樣CD8⁺ T細(xì)胞。

二．研究方法

該工作闡述了卵巢癌浸潤(rùn)性CD8⁺ T細(xì)胞的腫瘤識(shí)別功能主要取決于于組織駐留記憶（TRM）CD8⁺ T細(xì)胞。該研究對(duì)83, 454個(gè)CD3⁺CD8⁺CD103⁺CD69⁺ TRM細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq、scTCR-seq以及scATAC-seq測(cè)序和122個(gè)高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有前體組織駐留記憶CD8⁺ T細(xì)胞（TCF1 ^low TRM _stem ）可以預(yù)測(cè)卵巢癌的預(yù)后。

三．研究結(jié)果

1、TRM樣CD8⁺ TILs表現(xiàn)出胞啃特征，可以識(shí)別不同的抗原，并表現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤活性

為了鑒定能夠識(shí)別腫瘤抗原的TILs，該工作重點(diǎn)研究了CD8⁺ T細(xì)胞，這些細(xì)胞表現(xiàn)出胞啃誘導(dǎo)的來(lái)自于卵巢癌細(xì)胞的EpCAM蛋白轉(zhuǎn)移的跡象。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分析和多光譜成像流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約有1% ~ 4%的CD3⁺CD8⁺ TILs與EpCAM共染色，但在T細(xì)胞的mRNA水平上未檢測(cè)到EpCAM的表達(dá)（圖1A, 1B）。有趣的是，EpCAM⁺ TILs也表達(dá)CD103和CD69（圖1C），呈現(xiàn)TRM樣 CD8⁺ T細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記基因,它可以預(yù)測(cè)卵巢癌中更好的生存。這些細(xì)胞共表達(dá)CD49a，占HGSOCs樣本浸潤(rùn)的CD8⁺ TILs的60%（圖2A）。為了鑒定TRM淋巴細(xì)胞的其他特征，比較了來(lái)自相同腫瘤的（CD3⁺ CD8⁺ CD103⁺ CD69⁺ CD49a⁺）TRM樣CD8⁺ T細(xì)胞與（CD3⁺ CD8⁺ CD103^-）循環(huán)CD8⁺ T細(xì)胞（圖2A）。TRM樣CD8⁺ T細(xì)胞顯示T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物如PDCD1、LAYN、CTLA4、TIGIT、TOX和HAVCR2的高表達(dá)（圖2B），暗示了同源抗原的長(zhǎng)期暴露。TRM樣CD8⁺ T細(xì)胞也表現(xiàn)出較高的效應(yīng)基因表達(dá)，包括IFNG和GZMB，但較低水平的干細(xì)胞標(biāo)志物，如TCF7、IL7R、LEF1、CCR7和CD28。TRM樣T細(xì)胞也過(guò)表達(dá)CXCL13，與惡性腫瘤中的B細(xì)胞募集和新抗原負(fù)荷相關(guān)（圖2B）。為了進(jìn)一步支持TRM樣CD8⁺ T細(xì)胞與抗原的反復(fù)接觸結(jié)合，差異通路分析鑒定到有絲分裂細(xì)胞周期進(jìn)展特征，以及克隆擴(kuò)增和腫瘤缺氧相關(guān)特征（圖2C）。為了證實(shí)腫瘤反應(yīng)性CD8⁺ T細(xì)胞屬于組織駐留型CD8⁺ T細(xì)胞，該研究分析了HGSOCs樣本的TRM樣CD8⁺ TILs和循環(huán)CD8⁺ TILs的TCR免疫組庫(kù)。平均而言， TRM樣CD8⁺ TILs和循環(huán)CD8⁺ TILs中共享~12.5%的TCR - β鏈（圖2D）。正如預(yù)期的那樣，TRM樣CD8⁺ TILs具有較高的克隆多樣性（圖2E）。為了從功能上驗(yàn)證TRM樣CD8⁺ TILs在體內(nèi)的保護(hù)作用，將OVA特異性的OT-I T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到同源小鼠發(fā)育的側(cè)面OVA^low-UPK10卵巢腫瘤中（圖2F）。7天后，40%的腫瘤抗原特異性TILs具有TRM樣表型，其余的仍為循環(huán)CD8⁺ TILs（圖2G）。TRM樣表型的形成依賴(lài)于抗原的刺激，因此，未致敏的OT-I T細(xì)胞在OVA^neg腫瘤中無(wú)法獲得TRM樣的特征（圖2H）。最重要的是，從分離的腫瘤中恢復(fù)的CD103⁺ CD69⁺ 腫瘤抗原特異性TRM樣TILs比CD103^- OT-I T更有效地抑制了不同的OVA^low腫瘤的生長(zhǎng)（圖2I，J）。綜上所述，這些結(jié)果表明，在人類(lèi)卵巢癌中，TRM樣CD8⁺ TILs和循環(huán)CD8⁺ TILs表現(xiàn)出不同的表型和克隆多樣性，并且TRM樣CD8⁺ TILs在瘤床上表現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤活性。

2. TRM樣CD8⁺ TILs呈現(xiàn)從干細(xì)胞樣T細(xì)胞分化為耗竭T細(xì)胞的軌跡

對(duì)19193個(gè)CD103⁺CD69⁺CD8⁺ TRM樣CD8⁺ TILs和24175個(gè)循環(huán)CD8⁺ TILs進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq），并結(jié)合VDJ分析，根據(jù)基因表達(dá)譜和TCR相似性，確定了CD103⁺ CD69⁺ TRM樣CD8⁺ TILs的分化軌跡，CD103^-CD69⁺循環(huán)CD8⁺ TILs轉(zhuǎn)化為T(mén)CF7^low IL7R⁺CCR7⁺CD38^- CD8⁺ T細(xì)胞，并保留干性特征（TRM_stem）。這些干細(xì)胞樣CD8⁺ T細(xì)胞分化為GZMB⁺PRF1⁺GNLY⁺ZNF683⁺ TRM樣效應(yīng)CD8⁺ T細(xì)胞（TRM_eff），然后分化為T(mén)IGIT^lowHAVCR2^+/lowHLA-DR^highENTPD1^+/low TOX⁺ TRM樣具有高增殖特征的CD8⁺ T細(xì)胞（TRMprol），后轉(zhuǎn)化為耗竭的PD-1^high HAVCR2^highTIGIT^highENTPD1^highHLA-DR⁺TOX⁺CD8⁺ T細(xì)胞（TRMexh）（圖3A、3B）。并通過(guò)對(duì)同一細(xì)胞的基因表達(dá)和開(kāi)放染色質(zhì)的同時(shí)分析進(jìn)一步證實(shí)，在這些位點(diǎn)上顯示了同步的核RNA表達(dá)、富集的開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域和基因活性（圖3B-3E）。這些整合分析揭示了多個(gè)共調(diào)控基因模塊，包括與T細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)的基因（IL7R, CD28, CCR7, CD27, CXCR5），與T細(xì)胞效應(yīng)活性相關(guān)的基因（GZMB, GNLY, PRF1, IFNG），與T細(xì)胞增殖相關(guān)的基因（STMN1, MCM7, TOP2A, CDK1, DNMT1），以及與T細(xì)胞耗竭/功能障礙相關(guān)的分子（PDCD1, HAVCR2, TIGIT, CTLA4）。還發(fā)現(xiàn)了在特定TRM樣亞群中差異表達(dá)的新標(biāo)記，例如，在TRMeff/TRMprol/TRMexh分化過(guò)程中ETV1的表達(dá)逐漸增加。相比之下，GZMK的表達(dá)水平在TRM_stem細(xì)胞中最高，并在耗竭過(guò)程中逐漸降低（圖3B）。該分析還顯示，鋅指DNA結(jié)合域（ZNF, KLF, SP）在TRM_stem細(xì)胞中富集，而與核受體和同源結(jié)構(gòu)域（如POU結(jié)構(gòu)域）相關(guān)的motif在更分化的TRM樣亞群中富集，在TRM_exh細(xì)胞中FOX和HOX結(jié)構(gòu)域增加（圖3F）。進(jìn)一步的scVDJ分析/RNA-seq分析顯示， TRM樣CD8⁺ TILs和24175個(gè)循環(huán)CD8⁺ TILs共用13%的TCR（圖3G），然而TRM_stem與其他TRM樣細(xì)胞群共享24%的TCR。這些樣本中35%的TILs分化為T(mén)RM_eff和TRM_exh細(xì)胞，沒(méi)有TRM_stem細(xì)胞（圖3G）。然而，TRM_exh表現(xiàn)出典型耗竭T細(xì)胞特征HAVCR2/TOX/ENTPD1/CTLA-4的表達(dá)（圖3H）。TRM_stem細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有16%的TCR在TRM_exh細(xì)胞和其他非干細(xì)胞類(lèi)TRM樣細(xì)胞群之間共享，類(lèi)似于感染模型中的干細(xì)胞類(lèi)T細(xì)胞，TRM_stem細(xì)胞的ATAC-seq圖譜中沒(méi)有顯示出耗竭的跡象（圖3H）。

3. TRM_stem預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后

為了進(jìn)一步確認(rèn)TRM_stem TRM_eff TRM_prol TRM_exh的分化軌跡,進(jìn)行了額外的scRNA-seq測(cè)序,聯(lián)合VDJ分析了60010個(gè) TRM樣 CD8 ⁺ T細(xì)胞（圖4A）。正如預(yù)期，與其他TRM樣亞群相比，TCF1⁺ TRM_stem細(xì)胞表現(xiàn)出較低的CD103表達(dá)（圖4B、4C）。然而，它們也表達(dá)TRM樣分化的標(biāo)志物，包括編碼CD49a的ITGA1、RUNX3以及編碼LFA-1的兩個(gè)亞基的ITGAL和ITGB2。TRM_stem細(xì)胞也表達(dá)干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物，包括IL7R、CD28和CCR7。與針對(duì)特定腫瘤抗原的長(zhǎng)期反應(yīng)一致，TRM_exh細(xì)胞表現(xiàn)出最高的克隆多樣性（圖4D和4E）。在這些腫瘤中，57.7%的TRM樣克隆型與TRM_stem細(xì)胞共享998個(gè)TCR（圖4F、4G）?？紤]到只有40%的非冗余TCR存在于TRM樣TILs中（而在循環(huán)淋巴細(xì)胞中這一比例為67%），具有TRM_stem免疫組庫(kù)和分化的TRM樣細(xì)胞的克隆型僅占TCR的3%（相當(dāng)于13.4%的CD8⁺ TILs）。綜上所述，這些結(jié)果表明，只有一小部分循環(huán)CD8⁺ TILs可轉(zhuǎn)化為T(mén)RM_stem，隨后產(chǎn)生TRM_eff/ TRM_prol/ TRM_exh CD8⁺ T細(xì)胞。為了驗(yàn)證TRM_stem TILs在人卵巢癌中的保護(hù)作用，接下來(lái)對(duì)122個(gè)不同注釋的HGSOCs進(jìn)行了多重免疫熒光（圖5A, B）。TRM樣CD8⁺ TILs與循環(huán)CD8⁺ TILs的高比率與總體生存改善相關(guān)（圖5C）。值得注意的是，TRM樣CD8⁺ TILs主要位于腫瘤胰島內(nèi)，而循環(huán)CD8⁺ TILs分散在基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞中（圖5D）。表達(dá)TRM_stem標(biāo)記物TCF1的CD3⁺ CD8⁺ CD103^low CD69⁺ TRM樣CD8⁺ TILs的腫瘤浸潤(rùn)也與改善的預(yù)后密切相關(guān)（圖5E）。相反，TCF1⁺ CD103^- CD8⁺ 干細(xì)胞樣循環(huán)CD8⁺ TILs細(xì)胞（圖5F），或TCF1⁺ CD103⁺ CD8⁺ CD69⁺ 循環(huán)CD8⁺ TILs細(xì)胞（圖5G）則不能顯著影響預(yù)后。類(lèi)似地，CD103⁺ CD69⁺ CD8⁺ （分化的TRM樣）TILs與預(yù)后也無(wú)顯著相關(guān)性（圖5H）。不同細(xì)胞類(lèi)型間的相互作用分析顯示，盡管TRM_stem細(xì)胞也與CD69⁺循環(huán)CD8⁺ TILs聚集在一起，但TRM_stem細(xì)胞與其他TRM樣細(xì)胞之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖5I，J）。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRM樣細(xì)胞的線(xiàn)性分化軌跡，同時(shí)也表明TRM樣TILs與更好的預(yù)后之間的聯(lián)系取決于TRM_stem細(xì)胞。

4. T細(xì)胞致敏的性能和同源抗原的持久性激活維持了抗腫瘤反應(yīng)性TRM_stem的活性

該研究在體外使用不同劑量的抗原激活OVA特異性T細(xì)胞但這并不影響其在OVA⁺腫瘤中的積累，以及腫瘤反應(yīng)性TRM樣T細(xì)胞的比例，或TRM_stem/TRM_eff的平衡（圖6A, B, C）。然而，腫瘤抗原特異性T細(xì)胞需要抗原提呈細(xì)胞的激活才能在腫瘤中聚集，這表明是T細(xì)胞的TME發(fā)生代謝性麻痹后無(wú)反應(yīng)（圖6D）。為了闡明抗原親和性在TRM_stem分化中的作用，接下來(lái)比較了在體外被OT-1 TCR同源抗原(SIINFEKL)激活的OT-I T細(xì)胞與低親和性配體Q4H7 (SIIQFEHL)和G4 (SIIGFEKL)之間的表型差異。低親和力性配體SIIQFEHL或SIIGFEKL的激活降低了腫瘤反應(yīng)性O(shè)T-I細(xì)胞在腫瘤中積聚的能力（圖6E）和進(jìn)行TRM樣分化的能力（圖6F）。此外，低親和力Q4H7或G4激活的TRM樣TILs中保留TCF1表達(dá)的較少，這表明TRM_stem形成有缺陷（圖6G），相比之下，TRM_eff的比例較高（圖6H）。除了致敏性能，抗原在腫瘤上的持久性刺激也是TRM_stem免疫組庫(kù)形成所必需的。因此，盡管體外活化的OT-I T細(xì)胞在OVA^-腫瘤中（圖6I），在沒(méi)有同源抗原刺激的情況下，TRM_stem/ TRM_eff比值顯著降低（圖6J）。綜上所述,這些研究結(jié)果表明,T細(xì)胞致敏性能和持久性腫瘤抗原的刺激是TRM_stem具備干細(xì)胞特性和組織駐留的混合特性免疫組庫(kù)形成所必需的,并逐步分化成一系列TRM樣T細(xì)胞,通過(guò)主動(dòng)識(shí)別腫瘤抗原,逐步達(dá)到耗竭狀態(tài)。

四、總結(jié)

該研究結(jié)果為卵巢癌的免疫生物學(xué)提供了多方面的見(jiàn)解，為改善免疫治療提供了新的機(jī)會(huì)，而免疫治療對(duì)大多數(shù)卵巢癌患者無(wú)效的原因有很多，例如阻礙T細(xì)胞激活，腫瘤的代謝限制，免疫抑制性髓樣細(xì)胞的積累。首先，該研究證明T細(xì)胞的免疫原性，即可以特異性識(shí)別腫瘤。因此，可使用特異性TILs擴(kuò)增或用特定TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的個(gè)性化治療卵巢癌。其次，該研究發(fā)現(xiàn)TRM樣CD8⁺ TILs及循環(huán)CD8⁺ TILs在表型和抗原識(shí)別方面非常不同。第三，確定關(guān)鍵的TRM_stem細(xì)胞是一種中間細(xì)胞類(lèi)型，同時(shí)具有干細(xì)胞樣和組織駐留特征。有趣的是，在以往的研究中，免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的有效性被歸因于與TRM樣CD8⁺ TILs不同的干細(xì)胞樣CD8⁺ TILs亞群的增殖，而也研究發(fā)現(xiàn)它依賴(lài)于TRM樣CD8⁺ TILs。另一個(gè)重要方面是，TRM樣分化使腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞能夠在瘤床上執(zhí)行更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)?？傊?，該研究結(jié)果證明一小部分循環(huán)CD8⁺ TILs經(jīng)歷TRM樣分化，轉(zhuǎn)化為T(mén)RM_stem TILs，具有產(chǎn)生新TRM樣TILs和執(zhí)行抗腫瘤效應(yīng)的能力，而另一些細(xì)胞在反復(fù)暴露于抗原后會(huì)直接進(jìn)入耗竭狀態(tài)。