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大家好呀，今天分享的文章題為通過整合scRNA-seq和網(wǎng)絡藥理學來確定骨肉瘤（OS）的治療靶點，文章思路清晰，于今年一月發(fā)表在《Frontiers in Pharmacology》（IF = 5.988）上，讓我們來一起學習一下吧！
一、摘要
骨肉瘤（Osteosarcoma , OS）是一種常見的原發(fā)性腫瘤，具有廣泛的異質性。本研究使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和網(wǎng)絡藥理學分析治療骨肉瘤的有效靶點。本研究共涉及兩套數(shù)據(jù)集：scRNA-seq數(shù)據(jù)集（GSE162454）、Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集（GSE36001），采用皮爾遜相關分析確定OS治療的關鍵靶點并對關鍵靶點進行了GO和KEGG分析。DeepDR算法用于預測骨肉瘤治療的潛在藥物。通過分子對接分析，驗證了預測藥物與關鍵靶點的結合能力。采用qRT-PCR方法檢測成骨細胞和OS細胞中關鍵靶點的表達。確定了與OS進展相關的5個關鍵靶點（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN）。長春新堿、地塞米松和長春堿可能與RUNX2、OMD和CD4形成一個很有前途的藥物靶點對來治療骨肉瘤。
二、結果
1、細胞簇的識別和降維分析
首先，作者對單細胞數(shù)據(jù)進行分析得到21個細胞簇共8種細胞類型，8種細胞類型的差異基因富集得到的KEGG通路存在顯著的異質性。
2、不同的細胞類型分析
接下來，作者利用CIBERSORT算法和單細胞數(shù)據(jù)的8種細胞類型對Bulk RNA-seq （GSE36001）進行注釋，之前的研究表明免疫檢查點TDO2、PDCD1、LGALS9和PVR在癌癥治療和預后中發(fā)揮重要作用，計算免疫檢查點表達水平和細胞豐度之間的相關性發(fā)現(xiàn)：B細胞和TDO2的表達顯著相關、癌癥相關成纖維細胞（CAFs）和PDCD1的表達顯著相關、內皮細胞和LGALS9的表達顯著相關、漿細胞PVR 的表達顯著相關。（圖2）
3、篩選OS相關的靶點
作者首先從數(shù)據(jù)庫中檢索到了4236個OS相關靶點，隨后與四種細胞的標記基因進行重疊共得到289個靶點，使用Pearson相關分析篩選表達水平與四種細胞類型豐度顯著相關的基因共得到17個關鍵靶點。通過TARGET數(shù)據(jù)庫搜索這17個靶點和OS生存之間的信息，通過Cox回歸分析得到5個與預后相關的靶點（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3、JUN）。隨后作者基于多變量Cox回歸算法構建了由這5個基因組成的聯(lián)合預后標記物模型。結果顯示，這5個關鍵基因能夠準確地評估OS的風險。此外，在OS的3年和5年生存率分析中，受試者操作者特征（ROC）曲線的曲線下面積（AUC）值均大于0.72。眾所周知，癌細胞可以通過失調免疫檢查點蛋白來進行免疫逃逸。為了驗證這5個關鍵基因對生存風險分組準確性（分為高風險組和低風險兩組），作者檢測了免疫檢查點BTLA和PDL1的表達，低風險組中BTLA和PDL1（CD274）的表達水平高于高風險組。（圖3-4）
4、PPI網(wǎng)絡的構建與功能富集分析
利用STRING數(shù)據(jù)庫對這17個基因構建蛋白質互作網(wǎng)絡（PPIN），得到161個交互關系。（圖5）
對這17個基因進行KEGG和GO注釋，得到了787個GO term，在生物學過程方面（BP）：與ERK1和ERK2級聯(lián)、MAPK級聯(lián)和趨化性的調控有關；在細胞組分方面（CC）：位于轉錄調控復合物、RNA聚合酶II轉錄調控復合物和質膜的外側；在分子功能方面（MF）：與DNA結合轉錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異性、生長因子結合和蛋白酪氨酸激酶活性有關。同時，KEGG分析得到77條通路，主要富集在MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路和人類T細胞白血病病毒一型感染。（圖6）
5、藥物-靶標相互作用的預測
使用DeepDR算法，獲得了10種與OS相關性較高的藥物，隨后作者利用DeepPurpose算法預測了17個關鍵靶點與10種藥物之間的相互作用關系（圖7），篩選得到了6種藥物（DB04572、DB01005、DB01234、DB00541、DB00570和DB00309），這些藥物可能作用于這17個關鍵靶點。為了證實這6種藥物適合于OS的治療，本文使用AutoDock Vina對6種藥物與CD4、RUNX2、OMD、COL9A3、JUN進行了分子對接分析。對接結果顯示：RUNX2、CD4和OMD都與長春新堿（DB00541）、長春堿（DB00570）、地塞米松（DB01234）具有良好的結合親和力。（圖8）
6、細胞驗證試驗
為評價關鍵靶點對OS的預后影響，采用RT-qPCR法檢測CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN在OS和成骨細胞中的表達。結果顯示，與hFOB1.19細胞相比，OS細胞中CD4、OMD、JUN的表達降低，而RUNX2和COL9A3的表達增加（圖9）。
三、小結
本研究利用單細胞數(shù)據(jù)對RNA-seq進行注釋分析免疫檢查點和細胞豐度之間的相關性，發(fā)現(xiàn)B細胞與TDO2表達、癌癥相關成纖維細胞（CAFs）與PDCD1表達、內皮細胞與LGALS9表達、漿細胞與PVR 表達顯著相關。通過數(shù)據(jù)庫篩選出和OS相關的靶點和這四類細胞的標記基因取交集，并進行和細胞豐度相關性分析篩選得到17個靶點，通過數(shù)據(jù)庫尋找這17個靶點和生存之間的關系，篩選出5個和預后相關的靶點構建了風險模型并驗證了模型的有效性。通過KEGG和GO分析對這17個靶點進行功能注釋，利用分子對接研究靶點潛在藥物。本文邏輯清晰，篩選出了OS相關靶點對應的藥物并進行分子對接作為驗證。感興趣的小伙伴可以進行復現(xiàn)哦~
Wang Y, Qin D, Gao Y, Zhang Y, Liu Y, Huang L. Identification of therapeutic targets for osteosarcoma by integrating single-cell RNA sequencing and network pharmacology. Front Pharmacol. 2023 Jan 6;13:1098800. doi: 10.3389/fphar.2022.1098800IF: 5.988 Q1 . PMID: 36686663; PMCID: PMC9853455.
