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腫瘤微環(huán)境是一個由多種細胞構(gòu)成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，包括癌細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞，這些細胞之間的相互作用會共同維持腫瘤的發(fā)生發(fā)展。了解腫瘤微環(huán)境中的細胞表型，對了解癌癥進展和治療至關(guān)重要，單細胞測序技術(shù)的飛速發(fā)展也使人們能夠在更高分辨率下研究腫瘤微環(huán)境。生信人也介紹和分享了很多基于單細胞數(shù)據(jù)刻畫腫瘤微環(huán)境的文章，這些單細胞思路有的聚焦免疫細胞、有的關(guān)注成纖維細胞等基質(zhì)細胞、有的會對整個腫瘤微環(huán)境進行刻畫。小編今天再和大家分享一篇今年六月剛剛發(fā)表在 Molecular Cancer（IF:41.444）雜志上的關(guān)于前列腺癌微環(huán)境中內(nèi)皮細胞中關(guān)鍵基因的文章。文章結(jié)合組織及單細胞數(shù)據(jù)，生信與實驗結(jié)合，重點關(guān)注內(nèi)皮細胞這單個細胞類型中的關(guān)鍵基因，并對這個基因的互作與功能進行了詳細刻畫。文章邏輯非常清晰，有理有據(jù)，簡潔易懂是一篇十分值得借鑒學(xué)習(xí)的高分文章。
Comprehensive characterization of the prostate tumor microenvironment identifes CXCR4/CXCL12 crosstalk as a novel antiangiogenic therapeutic target in prostate cancer
全面刻畫前列腺癌微環(huán)境識別CXCR4和CXCL1交互作為新的抗血管生成治療靶點
一．研究背景
腫瘤微環(huán)境(TME)在腫瘤的進展和治療調(diào)控過程中具有高度動態(tài)性和內(nèi)在復(fù)雜性，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的相互作用會促進前列腺癌(PCa)的進展和擴散。因此，深入了解PCa腫瘤微環(huán)境(TME)改變過程中的細胞間通信網(wǎng)絡(luò)能夠促進新的治療策略開發(fā)。小編今天介紹的文章就對PCa的腫瘤內(nèi)皮細胞(TEC)進行了詳細的刻畫，并解析了TEC和PCa TME之間的細胞交互。
二．文章摘要
文章對從67例根治性前列腺切除術(shù)(RP)標本中分離出的TEC進行了多組學(xué)體外刻畫，并通過免疫組化(IHC)和免疫熒光(IF)對TEC的功能和關(guān)鍵標志物進行了驗證。首先，為了識別TEC的細胞與細胞相互作用靶點，作者對4例接受RP的PCa患者進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)，以探索細胞內(nèi)TME組成。接著作者通過免疫組化、公開數(shù)據(jù)集、細胞培養(yǎng)實驗以及PCa異種移植小鼠模型對靶點進行了驗證。結(jié)果RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)與相鄰正常內(nèi)皮細胞(NEC)相比，TEC中腫瘤血管、膠原修飾和細胞外基質(zhì)重塑相關(guān)基因表達上調(diào)，這一結(jié)果在一個獨立患者隊列中被IF和IHC證實。此外，通過scRNA-seq，作者識別了27種細胞亞類，包括具有動脈、靜脈和未成熟信號的內(nèi)皮細胞(EC)，以及血管生成EC。聚焦分子分析也發(fā)現(xiàn)與其他TME細胞亞群相比，動脈TEC顯示出CXCL12 mRNA水平升高，并與不良預(yù)后相關(guān)。
三．數(shù)據(jù)及方法
1. 生物實驗：作者使用根治性前列腺切除術(shù)(RP)獲得的活檢組織樣本分離內(nèi)皮（EC），進行內(nèi)皮細胞培養(yǎng)。后續(xù)也進行免疫熒光（IF）、免疫組化、細胞增殖、劃痕遷移實驗、細胞面積、細胞核面積、連接長度、定量RT-PCR及小鼠異種移植血管模型的分析。
2. RNA分析和測序：文章進行了組織和scRNA-seq測序。其中RNA-seq分析主要包括：1）數(shù)據(jù)預(yù)處理:作者使用STAR將組織RNA-seq讀取序列映射到人類基因組(GRCh38)，利用CellRanger軟件將scRNA-seq序列映射到人類基因組(GRCh38)，并使用UniApp平臺分析了原始、未篩選矩陣中的數(shù)據(jù)。2）質(zhì)量控制及數(shù)據(jù)標準化：研究中組織 RNA-seq 數(shù)據(jù)使用EdgeR包進行標準化，scRNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)控包括: (i) 刪除表達小于三個細胞的基因； (ii) 過濾掉基因表達小于200或者大于8000以及線粒體基因表達大于20%的細胞。后續(xù)對保留細胞的表達數(shù)據(jù)進行標準化。
3. 細胞聚類及注釋：自動縮放后，作者對標準化數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)，然后用t-SNE對前20個PCA進行可視化。接著使用Seurat對細胞進行高變基因篩選、標記識別及基于圖的聚類，并對細胞簇進行注釋。
4. 重新分析公開可用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集：研究使用之前發(fā)表的meta分析的數(shù)據(jù)驗證CXCL12在小鼠的TEC和NEC中的表達情況。
5. TCGA隊列分析：作者下載了TCGA中前列腺腺癌(PRAD)隊列的表達及臨床數(shù)據(jù)，在表達及通路水平執(zhí)行了生存分析及單因素cox分析。此外，作者也執(zhí)行了GSVA分析評估樣本通路富集得分。
四．研究的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 人前列腺組織TEC和NEC的分離、培養(yǎng)及識別
研究首先對從67例前列腺癌RP標本中分離出NEC和TEC進行純化并篩選EC標記CD31(圖1A)，并通過免疫細胞學(xué)檢測典型EC特征確定pca來源的TEC和NEC的內(nèi)皮表型（圖1B）。接下作者通過細胞培養(yǎng)產(chǎn)生足夠的細胞數(shù)，并對NEC和TEC進行功能特征和組織 RNA-seq等全面分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NEC相比，前列腺TEC表現(xiàn)出細胞增殖和遷移增加(圖1C-D)。此外，前列腺TEC在形態(tài)學(xué)上也有改變，例如整個細胞的大小增加(圖1E)以及細胞核面積增加(圖1F)，不過兩種EC的細胞核與細胞的比例大小相似(圖1F- G)。此外，作者也在TEC中觀察到更多的不連續(xù)細胞連接(圖1H)。
2. RNA - Seq揭示前列腺TEC和NEC之間的差異
在文章第二部分作者對5例配對TEC和NEC樣本以及9例非配對樣本進行了組織 RNA-seq，以確定前列腺TEC和NEC之間的分子差異。通過差異基因表達分析，作者識別了TEC和NEC之間驅(qū)動的差異基因，并確定了將TEC和NEC分開的40個基因特征（圖2A）。接下來作者通過對EC相關(guān)基因進行基因集富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)其與腫瘤血管系統(tǒng)相關(guān)（圖2B）。接著作者使用一個獨立的原發(fā)性PCa隊列對選定的TEC特征進行驗證（圖2C-E），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與良性前列腺組織中的NEC相比，TEC中所有標記的表達水平均較高，其中包括與血管相關(guān)的CXCL12、PTGIR、PLAC9和VDR。此外，體外培養(yǎng)的TEC和NEC中進行的IF實驗也證實這一結(jié)果(圖2F)。這些結(jié)果表明培養(yǎng)的前列腺TEC保持了體內(nèi)TEC的一些特征。
3. CXCL12是前列腺TEC標記物
由于培養(yǎng)的NEC和TEC之間的差異分析表明，CXCL12是上調(diào)最明顯的基因之一，且這一發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的EC上得到了IF的證實(圖3A-B)。因此，在這一部分，作者對TCGA中422例PCa患者隊列的公開數(shù)據(jù)進行深入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL12高表達與顯著較高的腫瘤復(fù)發(fā)率相關(guān)(圖3C)。接著為了確定CXCL12是否也在其他腫瘤類型的TEC中發(fā)生改變，作者使用了公開的TEC和NEC轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集，并分別對每個數(shù)據(jù)集進行了一項跨腫瘤的meta分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL12在大多數(shù)其他腫瘤實體中下調(diào)，但在培養(yǎng)的前列腺TEC中高度上調(diào)(圖3D)。
4. 前列腺TME的單細胞圖譜確定了產(chǎn)生CXCL12的細胞類型
在這一部分作者為了研究TEC標志物和CXCL12在全TME中的表達，對4例PCa患者的RP組織進行了scRNA-seq分析(圖4A)，并對保留的16529個高質(zhì)量細胞進行了t-SNE可視化和聚類分析，結(jié)果識別到B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞和單核細胞、肥大細胞、上皮(和癌癥)細胞和成纖維細胞(圖4B-C)。接著作者通過對單個細胞群進行重聚類和注釋，發(fā)現(xiàn)總共有27個具有高度不同基因表達特征的亞群（圖4D-E）。作者也觀察到在不同患者之間，及在腫瘤和良性前列腺組織中，幾個亞群的分布存在差異(圖4F)。此外，作者識別了兩個高表達癌細胞標志物KLK3的上皮簇(圖5A)。作者也根據(jù)基因特征，將成纖維細胞分為常駐成纖維細胞和基質(zhì)細胞（圖5B），而巨噬細胞和單核細胞則被細分為M1，M2型巨噬細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）、樹突狀細胞和na?ve以及激活的單核細胞（圖4D-E）。作者對M1和M2亞型巨噬細胞的差異分析也揭示了致癌M2表型的新標記以及CXCL12表達上調(diào)（圖5C）。
5. 刻畫腫瘤細胞內(nèi)皮細胞亞群
在這一部分，作者對先前分析發(fā)現(xiàn)的表達動脈、靜脈、未成熟血管等細胞特征的4類腫瘤EC進行了分析（圖6A）。作者發(fā)現(xiàn)這些細胞群表達高度不同的標志物，其中一些已被IHC驗證(圖6A-B)。作者通過組織RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)TEC標志物CXCL12在動脈EC中表達最高(圖6C)。通過NEC和TEC的差異分析，作者也發(fā)現(xiàn)CXCL12是動脈TEC中上調(diào)最高的基因之一(圖6D)。此外，作者發(fā)現(xiàn)IHC對CXCL12進行的蛋白水平驗證與單細胞分析一致，CXCL12在原發(fā)性PCa樣本的TEC中高度特異表達(圖6E)。最后，作者結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)高表達動脈EC marker的患者預(yù)后更差(圖6F)。此外，靜脈和未成熟細胞的EC亞群特征基因也與不良預(yù)后相關(guān)(圖6G-I)。
6. 相互作用分析揭示CXCR4聯(lián)合CXCL12是候選的抗血管生成靶點
在文章這一部分，作者進一步評估了CXCL12在動脈EC中的表達，并與所有間質(zhì)細胞進行了比較。結(jié)果作者發(fā)現(xiàn)與其他細胞類型相比，CXCL12在與血管生成相關(guān)的細胞亞型中顯著高表達(圖7A)，且腫瘤動脈EC表達CXCL12最高，血管生成表型也是如此(圖7A)。接著作者為了更好地理解動脈EC相關(guān)的CXCL12在PCa TME中的作用，使用CellPhoneDB進行互作分析(圖7 B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在免疫細胞，中存在CXCL12到同源受體CXCR4的信號(圖7 B)，且與其他EC表型相比，尖端細胞高度過表達CXCR4(圖7C)。這些發(fā)現(xiàn)表明靶向CXCR4及CXCL12抑制血管生成可能是一個潛在的治療靶點。
7. 體外和體內(nèi)CXCR4/CXCL12抑制PCa的功能驗證
在文章最后一部分，通過RT-PCR分析，作者發(fā)現(xiàn)與NEC相比，TEC中CXCL12及其同源受體CXCR4的表達上調(diào)(圖8A)，且CXCL12與CXCR4互作可以促進血管形成，而CXCR4拮抗劑可以抑制新生血管形成。由于發(fā)現(xiàn)CXCR4及CXCL12信號通路會在PCa TEC中觸發(fā)新生血管，作者驗證了CXCR4拮抗劑對TEC增殖能力的降低(圖8B)，以及細胞遷移的升高(圖8C)。接下來作者利用之前的一項小鼠研究，對血管進行了免疫組化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠的所有腫瘤均有CD31+血管，而在使用CXCR4拮抗劑治療的6只小鼠的腫瘤中，2只有局灶性瘤內(nèi)或瘤周血管，與對照組小鼠相比沒有出現(xiàn)分布瘤內(nèi)血管的腫瘤(圖8D-E)。
到這里文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章使用組織及單細胞數(shù)據(jù)，生信分析及實驗驗證相結(jié)合，深度刻畫了PCa微環(huán)境中的TEC關(guān)鍵基因的功能來探索其影響腫瘤發(fā)展的潛在分子機制，并在復(fù)雜的PCa基質(zhì)細胞相互作用中識別了潛在靶點。文章只重點關(guān)注了一個細胞類型，并深度研究了其關(guān)鍵基因的功能，條理清晰，層層遞進，有理有據(jù)，十分值得小伙伴們參考學(xué)習(xí)。
