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人乳腺癌單細(xì)胞深度解析
今天給大家介紹一篇人乳腺癌的單細(xì)胞測序文章，該篇文章發(fā)表在Nature Genetics，該期刊在最近一年的影響因子為38.33，比上一年增加了10.727。中科院大類: 生物學(xué) 1區(qū)中科院小類: 1區(qū) 遺傳學(xué)。這篇文章最大的特色是深度解析人乳腺癌單細(xì)胞測序。
根據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的表達(dá)和人表皮生長因子受體2(HER2)的過度表達(dá)或HER2基因ERBB2的擴(kuò)增，對乳腺癌進(jìn)行臨床分層。形成了三個(gè)與預(yù)后相關(guān)并確定治療策略的廣泛亞型：Luminal(ER+，PR+/?)；HER2+(HER2+，ER+/?，PR+/?)；以及三重陰性乳腺癌(TNBC；ER?，PR?，HER2?)。根據(jù)使用PAM50基因signature的轉(zhuǎn)錄圖譜，乳腺癌也被分成五個(gè)“intrinsic”分子亞型：luminal（官腔樣型）樣型(Luma和Lumb)；HER2富集型(HER2E)；基底樣型；以及正常型。分子亞型和臨床亞型之間有大約70-80%的符合率。雖然PAM50對預(yù)后和治療提供了重要的見解，但目前對這些亞型在細(xì)胞分辨率上的功能理解是有限的。
人類乳腺癌的高分辨率細(xì)胞景觀
總共有130,246個(gè)單個(gè)細(xì)胞通過了質(zhì)量控制，并使用規(guī)范的譜系標(biāo)記進(jìn)行了注釋(Fig. 1a,b)。使用已發(fā)表的基因signatures進(jìn)一步證實(shí)了這些高級注釋。所有主要細(xì)胞類型在腫瘤和臨床亞型中均有表達(dá)(Fig. 1c)。正如先前在其他癌癥中所報(bào)道的那樣，UMAP可視化顯示按腫瘤清楚地分離上皮細(xì)胞，盡管三個(gè)簇包含來自多個(gè)患者和亞型的細(xì)胞(Fig. 1d,e)。這些細(xì)胞經(jīng)鑒定為正常乳腺上皮細(xì)胞(Fig. 1f)。由于乳腺癌在很大程度上是由DNA拷貝數(shù)變化驅(qū)動(dòng)的，作者使用inferCNV估計(jì)了單細(xì)胞拷貝數(shù)變異(Cnv)譜，以區(qū)分腫瘤和正常上皮細(xì)胞(Fig. 1f)。這揭示了患者特有的拷貝數(shù)變化，以及在乳腺癌中常見的那些變化，例如管腔癌中chr1q的增加和基底樣癌中chr5q的丟失。
SCSubtype：scRNA-seq數(shù)據(jù)的內(nèi)在子類型
由于單細(xì)胞數(shù)據(jù)固有的稀疏性，作者開發(fā)了一種與scRNA序列兼容的內(nèi)在分子分型方法。作者根據(jù)每個(gè)腫瘤的scRNA-seq構(gòu)建了“Pseudobulk”圖譜，并應(yīng)用了PAM50質(zhì)心預(yù)測因子。為了確定一個(gè)穩(wěn)定的訓(xùn)練集，作者使用了使用大約2,000個(gè)基因的固有乳腺癌基因list3和1,100個(gè)乳腺腫瘤的癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集，對Pseudobulk進(jìn)行了分層聚類。訓(xùn)練樣本選自在Pseudobulk PAM50亞型和TCGA聚類之間具有一致性的樣本。對于訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的每個(gè)PAM50亞型，作者進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞和差異基因表達(dá)的成對整合，以確定4組定義單細(xì)胞衍生分子亞型的基因。作者將這些基因定義為“SCSubtype”基因signatures(Fig. 2a)。SC亞型顯示，在20個(gè)樣本中，有13個(gè)腫瘤細(xì)胞不到90%屬于一個(gè)分子亞型，而只有一個(gè)腫瘤(CID3921；HER2E)顯示出完全同質(zhì)的分子亞型(Fig. 2b)。在一些腔內(nèi)腫瘤和HER2E腫瘤中，SC亞型預(yù)示著少量的基底樣細(xì)胞，并且作者在兩個(gè)ER+的病例中用免疫組織化學(xué)(IHC)證實(shí)。在其他ER+的腫瘤細(xì)胞中，有少量形態(tài)上的惡性細(xì)胞ER陰性，細(xì)胞角蛋白-5(CK5)陽性，細(xì)胞角蛋白-5(CK5)是基底細(xì)胞標(biāo)志物(Fig. 2c). 為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCSubtype，作者計(jì)算了上皮細(xì)胞分化度(DScore)和增殖度，這兩個(gè)指標(biāo)都與每個(gè)細(xì)胞的分子亞型獨(dú)立相關(guān)。Basic_SC細(xì)胞傾向于低DScore和高增殖分?jǐn)?shù)，而Luma_SC細(xì)胞顯示高DScore和低增殖分?jǐn)?shù)(Fig. 2d)，正如在TCGA中觀察到的PAM50亞型。
驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的復(fù)發(fā)基因模塊
以前的方法依賴于“bulk”分子亞型的先驗(yàn)知識來開發(fā)分類器。為了補(bǔ)充這一點(diǎn)，作者以一種無監(jiān)督的方式調(diào)查了驅(qū)動(dòng)腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(Itth)的信號通路，使用至少50個(gè)腫瘤細(xì)胞的整合聚集性，產(chǎn)生了574個(gè)itth的基因signatures?；蚣患b定了這些轉(zhuǎn)基因生物共有的和不同的功能特征(Fig. 2e) GM4在包括MKI67、PCNA和CDK1在內(nèi)的基因驅(qū)動(dòng)下，獨(dú)特地富集了細(xì)胞周期和增殖的特征(例如，E2F_靶標(biāo))。GM3主要富集干擾素反應(yīng)（IFITM1/2/3，IRF1），抗原呈遞（B2M；HLA-A/B）和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志(EMT; VIM, ACTA2)。Gm1和Gm5具有雌激素反應(yīng)途徑的特征，而Gm1也富集到缺氧、腫瘤壞死因子-α和p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡等通路上。當(dāng)將所有腫瘤細(xì)胞的簽名分?jǐn)?shù)關(guān)聯(lián)起來時(shí)，也可以看到類似的功能關(guān)聯(lián)。對于每個(gè)腫瘤細(xì)胞，作者計(jì)算了七個(gè)GMs的簽名分?jǐn)?shù)，并使用分層聚類來識別細(xì)胞相關(guān)性。這清楚地將腫瘤細(xì)胞分組，減少了圖1d-f中所見的巨大的腫瘤間變異性。作者還發(fā)現(xiàn)有一些模塊與SCSubtype調(diào)用相關(guān)聯(lián)，而其他模塊則顯示與更多樣化的子類型關(guān)聯(lián)(Fig. 2f,g)。最后，作者使用基于GM的細(xì)胞狀態(tài)分配來觀察腫瘤細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。類似于SCSubtype(Fig. 2b)，作者看到了細(xì)胞異質(zhì)性的證據(jù)，這種異質(zhì)性與腫瘤亞型大致一致，但不受腫瘤亞型的限制(Fig. 2h)。SCSubtype和GM分析為腫瘤性ITH的分類提供了互補(bǔ)的新方法，并提供了進(jìn)一步的證據(jù)表明癌細(xì)胞在大多數(shù)腫瘤中表現(xiàn)出不同的表型。
乳腺癌的免疫環(huán)境
為了高分辨率地檢測乳腺腫瘤的免疫環(huán)境，作者將免疫細(xì)胞重新聚集，以鑒定T細(xì)胞和先天淋巴樣細(xì)胞、髓系細(xì)胞、B細(xì)胞和漿母細(xì)胞。作者使用轉(zhuǎn)錄本和表位的細(xì)胞索引通過測序(cite-seq)對4個(gè)樣本進(jìn)行免疫表型分型，并進(jìn)行基于錨點(diǎn)的整合以將蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)移到剩余的病例，這顯示出與實(shí)驗(yàn)測量值高度相關(guān)。
淋巴細(xì)胞和先天淋巴樣細(xì)胞
作者在患者中識別了18個(gè)T細(xì)胞和先天淋巴細(xì)胞團(tuán)(Fig. 3a)。CD4簇包括CD25蛋白標(biāo)記的FOXP3+的調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞：Foxp3/c2)、濾泡輔助T(TFH)細(xì)胞(CXCL13、IL21和PDCD1；CD4+T細(xì)胞：CXCL13/c3)、幼稚/中央記憶CD4+(CD4+T細(xì)胞：CCR7/c0)和1型輔助T(TH1)CD4效應(yīng)記憶T(TEM)簇(CD4+T細(xì)胞：IL7R/C1)(Fig. 3b)。作者還根據(jù)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞：AREG/C9)和自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞：FCGR3A/C10)的αβT細(xì)胞受體和NK標(biāo)志(KLRC1、KLRB1、NKG7)的表達(dá)，鑒定了NK細(xì)胞(NK細(xì)胞：AREG/C9)和自然殺傷T樣細(xì)胞(NKT細(xì)胞：FCGR3A/C10)(Fig. 3b) 。與TNBC中TILs和CD8+T細(xì)胞的富集相一致，T細(xì)胞簇Ifit1/c6、LAG3/c8和MKI67/c11在TNBC樣本中所占比例較高(Fig. 3c)。這些群集在臨床亞型之間有質(zhì)的差異，在TNBC病例中，來自LAG3/c8和IFNG/c7群集的CD8+T細(xì)胞具有顯著更高的功能障礙分?jǐn)?shù)(Fig. 3d)。此外，腔內(nèi)腫瘤和HER2+腫瘤的檢查點(diǎn)分子表達(dá)不同于TNBC (Fig. 4f)。值得注意的是，在TNBC中，LAG3/c8缺失的CD8亞群PD-1（PDCD1）、LAG3以及CD27和CD70的配體-受體對的表達(dá)明顯增高，這些亞群可以增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Fig. 4f)。作者檢測了PDCD1、CD27、LAG3和CD70在乳腺癌國際聯(lián)合會(METABRIC)40個(gè)隊(duì)列的分子分類中的表達(dá)，這些分子在基底樣亞型和HER2+亞型中持續(xù)富集。當(dāng)作者使用無監(jiān)督的分層聚類檢查整個(gè)數(shù)據(jù)集中時(shí)(更廣泛的免疫檢查點(diǎn)分子列表),臨床亞型之間檢查點(diǎn)分子表達(dá)的差異更為明顯，包括在CAF等非免疫細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)提供了對每種亞型疾病最合適的免疫治療策略的見解。當(dāng)作者重新聚集B細(xì)胞時(shí)，作者觀察到兩個(gè)主要的亞群(幼稚和記憶B細(xì)胞)，其中漿母細(xì)胞形成一個(gè)單獨(dú)的簇。另外的亞群似乎主要是由B細(xì)胞抗原受體特異性基因片段驅(qū)動(dòng)的，而不是可變的生物基因表達(dá)程序。
髓系細(xì)胞
髓系細(xì)胞形成13個(gè)簇，在所有腫瘤中都能以不同的頻率被識別出來(Fig. 4a)。沒有檢測到粒細(xì)胞，可能是因?yàn)樗鼈儗δ[瘤解離方案的敏感性和它們的低豐度。單核細(xì)胞形成三個(gè)簇：Mono：IL1B/c12；Mono：S100A9/c8；和Mono：FCGR3A/c7。Mono：FCGR3A群體形成了一個(gè)以CD16蛋白高表達(dá)為特征的獨(dú)特的小簇(Fig. 4b,c)。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的巨噬細(xì)胞群(LAM1：FABP5/c1和LAM2：APOE/c2)，超出了傳統(tǒng)的M1/M2分類，占總髓系細(xì)胞的30-40%(Fig. 4a–c)。這些細(xì)胞與在肥胖小鼠和人類中擴(kuò)張的脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LAM)群體具有密切的轉(zhuǎn)錄相似之處，包括TREM2和脂質(zhì)/脂肪酸代謝基因(如FABP5和APOE)的高表達(dá)(Fig. 4c)。LAM1/2獨(dú)特表達(dá)CCL18，其編碼的趨化因子在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤促進(jìn)中起重要作用。作者觀察到在HER2+腫瘤中LAM1:FABP5細(xì)胞的比例大大降低(Fig. 4d)。提示腫瘤基因組學(xué)或微環(huán)境的獨(dú)特特征決定了LAM1/2的命運(yùn)。使用METABRIC隊(duì)列進(jìn)行的生存分析表明，LAM1：FABP5特征與較差的生存相關(guān)(Fig. 4e)。而編碼PD-L1(CD274)和PD-L2(PDCD1LG2)的RNA在Mac：CXCL10和DC：LAMP3髓系群體中高度共表達(dá)(Fig. 4f)。對CITE-SEQ數(shù)據(jù)的分析表明，PD-L1和PD-L2蛋白在Mac：CXCL10，LAM1：FABP5，LAM2：APOE和DC：LAMP3簇中的表達(dá)分布更廣(Fig. 4b)。強(qiáng)調(diào)LAM1/2是免疫調(diào)節(jié)分子的重要來源。
基質(zhì)亞類與不同的分化狀態(tài)相關(guān)
在間質(zhì)隔室中，作者鑒定出三種主要的細(xì)胞類型(Fig. 5a,b)。包括CAFs(PDGFRA和COL1A1Fig. 5c,d) 血管周圍(PVL)細(xì)胞(MCAM/CD146、ACTA2、PDGFRb；Fig. 5e,f), 內(nèi)皮細(xì)胞(PECAM1/CD31和CD34；Fig. 5g,h)，外加兩個(gè)較小的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞群(LYVE1)和循環(huán)PVL細(xì)胞群(MKI67)。用Monocle 2進(jìn)行的偽時(shí)間軌跡分析揭示了五個(gè)CAF狀態(tài)(Fig. 5c)。對于PVL細(xì)胞，作者確定了三種狀態(tài)(Fig. 5e) 。PVL S1和S2表達(dá)與干細(xì)胞、未成熟周皮細(xì)胞(PDGFRb、ALDH1A1、CD44、CSPG4、RGS5和CD36)和粘附分子相關(guān)的標(biāo)記(ICAM1, VCAM1 and ITGB1)有關(guān)。它們進(jìn)一步在與受體結(jié)合和血小板衍生生長因子活性相關(guān)的通路上富集。RGS5、CD248和THY1定義S2的分支。與基因表達(dá)一致，在早期PVL狀態(tài)s1和s2中，CITE-SEQ顯示細(xì)胞表面CD90(THY1)以及整合素分子CD49a和CD49d出現(xiàn)富集(Fig. 5i,j)。隨著細(xì)胞向PVL s3過渡，這些標(biāo)志物的表達(dá)下降，PVL s3富含收縮相關(guān)基因（MYH11和ACTA2）(Fig. 5f)，以及與平滑肌表型相關(guān)的通路。PVL狀態(tài)部分富集到肌成纖維細(xì)胞樣CAF基因特征。CAF標(biāo)記物ACTA2的共同表達(dá)提示PVL S3細(xì)胞歷史上在IHC分析中被錯(cuò)誤地歸類為CAF。作者確定了三種內(nèi)皮狀態(tài)(Fig. 5g)。內(nèi)皮S1類似于柄狀內(nèi)皮細(xì)胞和小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ACKR1, SELE and SELP)，并且富集到與細(xì)胞粘附相關(guān)的途徑 (ICAM1和VCAM1)和抗原提呈/主要組織相容性復(fù)合物(HLA-DRA)。隨著細(xì)胞分成兩種狀態(tài)，這些標(biāo)記物隨著偽時(shí)間的延長而減少，兩者都伴隨著DLL4的表達(dá)升高，DLL4是一種內(nèi)皮尖狀細(xì)胞的標(biāo)記物(Fig. 5h)。
繪制乳腺癌異質(zhì)性的空間圖譜
為了深入了解細(xì)胞類型的空間組織，作者對6個(gè)樣本進(jìn)行了空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，其中包括來自作者scRNA-seq隊(duì)列的兩個(gè)ER+（CID4535和CID4290）和兩個(gè)TNBCs（CID44971和CID4465），以及另外兩個(gè)TNBCs（1142243F和1160920F）(Fig. 6a)。 為了解每個(gè)大約55微米直徑斑點(diǎn)的細(xì)胞組成，作者應(yīng)用了一個(gè)立體顯微鏡的概率模型，使用的是臨床亞型匹配的scRNA-seq數(shù)據(jù)。細(xì)胞類型與其適當(dāng)?shù)牟±碜⑨屜嚓P(guān)聯(lián)(Fig. 6b)。作者早些時(shí)候表明，GMs富集了不同的微環(huán)境相關(guān)途徑和因子。作者在6個(gè)病例中通過立體顯微鏡和病理學(xué)鑒定癌細(xì)胞的位置。然后檢查了7個(gè)GM signatures的強(qiáng)度。這揭示了在TNBC病例中GM3(EMT、IFN、MHC)和GM4(增殖)的預(yù)期富集，以及在ER+病例中GM1和GM5(ER、Luminal)的預(yù)期富集(Fig. 6c)。這些數(shù)據(jù)表明，這些GM不是基于解離方法的產(chǎn)物。為了系統(tǒng)地理解模塊之間的空間關(guān)系，作者計(jì)算了所有癌癥部位GM評分之間的皮爾遜相關(guān)性。這揭示了這兩個(gè)簇在六個(gè)案例中大部分是保守的，其中一個(gè)簇包括GM1、GM3、GM5和GM6，而另一個(gè)簇則是GM2和GM4 (Fig. 6d)。 有趣的是，GM3(EMT、IFN、MHC)和GM4(增殖)在所有樣本中都顯示出強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)(Fig. 6e–g)。這表明這些不同的癌癥表型發(fā)生在乳腺癌的相互排斥的區(qū)域。
繪制新的異型細(xì)胞相互作用圖
6個(gè)病例中有5個(gè)病例發(fā)現(xiàn)了肌成纖維細(xì)胞樣CAF和iCAF之間存在適度的負(fù)Pearson相關(guān)性(Fig. 7a–c)。在7例HER2+乳腺腫瘤的獨(dú)立空間轉(zhuǎn)錄學(xué)數(shù)據(jù)集中，CAF定位是一致的，這表明這種關(guān)系在臨床亞型中是保守的(Fig. 7a)。與上述iCAF的免疫調(diào)節(jié)特性一致，iCAF在兩項(xiàng)研究中都與幾個(gè)淋巴細(xì)胞群體共定位，包括記憶/幼稚B細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞(Fig. 7a 和 Fig. 7d,e)。6例肌成纖維細(xì)胞樣CAF與CD8+T細(xì)胞的相關(guān)(Fig. 7a)，這提示可能與高TIL浸潤或具有炎癥表型的浸潤性乳腺癌的功能相關(guān)。為了探索這些區(qū)域的CAF-淋巴細(xì)胞相互作用的潛在介質(zhì)，作者研究了CAF和CD4+/CD8+T細(xì)胞最豐富的部位的頂端配體-受體相互作用，并通過scRNA-seq檢測到了這兩種細(xì)胞類型所檢測到的頂端配體-受體相互作用。這揭示了免疫調(diào)節(jié)因子配體和同源T細(xì)胞受體的富集，包括趨化因子(CXCL12/CXCL14-CXCR4和CXCL10-CXCR3)、補(bǔ)體途徑、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGFB1/TGFB3-TGFBR2)和淋巴細(xì)胞抑制/激活分子(LTB-LTbR、TNFSF14-LTbR和LTB-CD40、VTCN1/B7H4-B) (Fig. 7f)。通過將信號預(yù)測與周圍細(xì)胞鄰相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)突出了CAF直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞。在所有Viium病例中，LAM1和LAM2細(xì)胞均出現(xiàn)在浸潤性癌區(qū)；然而，從形態(tài)學(xué)上看，LAM2也存在于間質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的區(qū)域。LAM1和LAM2細(xì)胞在大多數(shù)情況下表現(xiàn)出適度的空間負(fù)相關(guān)，這可能表明一個(gè)共同的LAM細(xì)胞通過其局部的TME向LAM1或LAM2極化(Fig. 7a) 在三種亞型的八種腫瘤中，LAM2細(xì)胞而不是LAM1細(xì)胞與CD4+和CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)(Fig. 7a) 此外，在許多病例中，Mac：CXCL10/c9和CD8T細(xì)胞之間存在正的Pearson相關(guān)性(Fig. 7a)，這主要集中在標(biāo)記為浸潤性癌+間質(zhì)+淋巴細(xì)胞的斑點(diǎn)上(Fig. 7g)。提示這些生態(tài)位在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫方面可能具有功能相關(guān)性。
乳腺腫瘤生態(tài)型與患者生存相關(guān)。
作者的單細(xì)胞數(shù)據(jù)產(chǎn)生了乳腺腫瘤的細(xì)胞分類方案，在26個(gè)腫瘤中觀察到細(xì)胞頻率的顯著變異和重復(fù)模式。于是作者假設(shè)乳腺癌的亞群可能具有相似的細(xì)胞組成和腫瘤生物學(xué)。并且對METABRIC隊(duì)列中的所有原發(fā)性乳腺腫瘤數(shù)據(jù)集進(jìn)行了去卷積。共識聚類顯示，有9個(gè)腫瘤簇具有相似的估計(jì)細(xì)胞成分(‘ecotypes’) (Fig. 8a–c)。這些生態(tài)型與腫瘤亞型、SC亞型細(xì)胞分布和多種主要細(xì)胞類型相關(guān)(Fig. 8a)。生態(tài)型3(E3)的腫瘤富含Basal_SC、Cycling和Luminal_前體細(xì)胞(推測是基底乳腺癌的起源細(xì)胞)和基本PAM50亞型(Fig. 8a,b)。而E1、E5、E6、E8和E9則以腔細(xì)胞為主。生態(tài)型還具有獨(dú)特的基質(zhì)和免疫細(xì)胞富集模式。E4高度富集到與抗腫瘤免疫相關(guān)的免疫細(xì)胞(Fig. 8a) 。包括耗竭的CD8T細(xì)胞(LAG3/c8)、TH1(IL7R/C1)和中央記憶性CD4 T細(xì)胞(CCR7/c0)。E2主要由LumA和正常樣腫瘤組成(Fig. 8b) 。至于預(yù)后，E2腫瘤患者的預(yù)后最好(Fig. 8d,e)。而E3的腫瘤與較差的5年存活率有關(guān)(Fig. 8d)。這與已知的基底細(xì)胞樣高增殖性腫瘤預(yù)后不良是一致的。E7預(yù)后也較差，以HER2E腫瘤和HER2E_SC細(xì)胞富集為主。E4也有較高的HER2E和基底樣瘤富集(Fig. 8b)，然而，這些患者的預(yù)后明顯好于E7 (Fig. 8f)。可能是由于抗腫瘤免疫細(xì)胞的滲透所致。
在這項(xiàng)研究中作者為乳腺癌分類提供了一個(gè)完整的細(xì)胞模型的重要進(jìn)展。從三個(gè)層面定義了乳腺腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。首先，詳細(xì)介紹了包括脂肪細(xì)胞、肥大細(xì)胞和粒細(xì)胞的細(xì)胞類型。作者通過對完整組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄，部分解決了這一問題。與此同時(shí)，未來的工作可能會應(yīng)用互補(bǔ)技術(shù)，如單核或基于微孔的測序。其次是每個(gè)臨床亞型的病例數(shù)量有限，這限制了作者估計(jì)亞型特異性特征的能力。
