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一文告訴你“可變剪接”怎么發(fā)10分+
可變剪接(Alternative splicing, AS)在基因調(diào)控過程中起著重要作用，在癌癥中很常見。RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)是AS的分子決定因素之一，并且，RBP-基因網(wǎng)絡(luò)活性的擾動可能在一定程度上促進(jìn)癌癥的發(fā)展。近年來關(guān)于可變剪接的文章層出不窮，今天分享一篇2021年6月發(fā)表在Molecular Therapy-Nucleic Acids（IF: 10.183）的文章。這篇文章綜合AS擾動景觀分析識別了RBPs在癌癥中的潛在治療靶點(diǎn)，并為RBPs在癌癥中的調(diào)節(jié)功能提供了新的見解。感興趣就一起往下看看吧！
可變剪接（AS）在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。AS的擾動已經(jīng)在各種類型的癌癥中被發(fā)現(xiàn)，并且已經(jīng)證明AS可能會激活各種癌癥信號通路。此外，AS事件在癌癥組織中的臨床意義已被證明。盡管幾個(gè)候選基因中的AS事件已被確定為有助于癌癥的發(fā)展，但在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的癌癥特定或復(fù)發(fā)性剪接模式卻較少被研究。識別這些擾亂AS的分子調(diào)控對開發(fā)癌癥生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。
隨著計(jì)算和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，癌癥中AS事件的遺傳和表觀遺傳決定因素已被發(fā)現(xiàn)。AS的失調(diào)可能受到體細(xì)胞突變、反義RNA、RNA結(jié)合蛋白（RBPs）、轉(zhuǎn)錄因子（TFs）和表觀遺傳因子的調(diào)控。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，可能調(diào)節(jié)AS事件的體細(xì)胞突變在RBPs中富集。RBPs在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著不可缺少的作用。越來越多的RBPs被確定為各種類型癌癥中AS事件的調(diào)節(jié)器。例如，RBP RALY促進(jìn)了乳腺癌中精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1的交替剪接異構(gòu)體V2的表達(dá)和轉(zhuǎn)移潛力。RBP ZMAT3是抑制結(jié)直腸癌中CD44剪接的調(diào)節(jié)因子。研究還發(fā)現(xiàn)，EIF2S2敲除聯(lián)合奧沙利鉑治療可能是一種潛在的癌癥聯(lián)合治療方法。
本文系統(tǒng)地分析了不同癌癥類型的全基因組替代剪接擾動。作者還提出了一個(gè)計(jì)算管道，以確定AS擾動的RBP調(diào)節(jié)器，并發(fā)現(xiàn)這些RBP調(diào)節(jié)器在癌癥標(biāo)志相關(guān)途徑中發(fā)揮重要作用。此外，研究人員根據(jù)RBP調(diào)節(jié)器的表達(dá)確定了不同的亞型，這些亞型的患者表現(xiàn)出不同的生存和通路活性。文章最后還確定了藥物與RBP的相關(guān)性，這為癌癥治療提供了新的潛在藥物。
癌癥中受干擾的AS事件的景觀
為了確定AS在不同癌癥類型中的全面失調(diào)，作者系統(tǒng)地分析了TCGA隊(duì)列中18種人類癌癥的mRNA剪接譜（圖1A）。總共有7245個(gè)癌癥樣本和735個(gè)正常樣本。在所有的癌癥類型中，發(fā)現(xiàn)了大量的剪接事件，而且不同的癌癥類型之間剪接類型的比例沒有太大差異（圖1B）。分析中總共考慮了七種類型的AS事件，包括外顯子跳躍（ES），替代供體位點(diǎn)（AD），替代接受體位點(diǎn)（AA），保留內(nèi)含子（RI），互斥外顯子（ME），替代終止子（AT），以及替代啟動子（AP）。最常見的剪接事件是ES，占整個(gè)癌癥總事件的34.5%-41.4%（圖1B）。相比之下，最不常見的AS事件是ME，它只占整個(gè)癌癥類型總事件的0.3%-0.6%。接下來作者確定了每種癌癥類型中的擾動AS事件(perturbed AS events, PASEs)。研究發(fā)現(xiàn)在癌癥中AS事件被擾亂的比例很高，不同癌癥類型的PASEs數(shù)量不同（圖1C，頂部）。作者將具有較高剪接百分比（PSI）值的AS事件定義為癌癥中的上調(diào)AS事件，而具有較低PSI值的AS事件被指定為下調(diào)AS事件。在KIRC和胃腺癌（STAD；圖1C）中發(fā)現(xiàn)了更多上調(diào)的AS事件。在乳腺浸潤癌（BRCA）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）和甲狀腺癌（THCA；圖1C）中有更多下調(diào)的AS事件。作者還探討了不同AS類型在癌癥中被擾亂的程度。計(jì)算了每種類型的AS事件的概率（OR）。雖然ES事件被擾亂的數(shù)量較多，但PASEs可能在AP和AT類型中富集（圖1C；底部）。此外，癌癥中上調(diào)的PASEs在不同的癌癥中也富集于RI剪接類型（圖1C；底部）。這與最近觀察到的RI是癌癥干性和侵襲性的標(biāo)志是一致的。這些結(jié)果表明，在不同的癌癥類型中普遍存在AS的改變。
PASEs提示腫瘤的組織起源
具有相似組織起源的癌癥類型往往具有一些共同的分子特征，如基因表達(dá)和DNA甲基化。作者接下來調(diào)查了具有相似組織起源的癌癥類型是否表現(xiàn)出相似的PASEs。首先用t分布的隨機(jī)鄰接嵌入（t-SNE）將整個(gè)癌癥隊(duì)列的AS多樣性可視化。這突出了AS事件的組織特異性和癌癥類型的差異和共性（圖2A）。文章發(fā)現(xiàn)了起源相似且經(jīng)常被描述為具有類似分子特征的癌癥類型，如腎臟腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、KIRC和腎臟嗜鉻細(xì)胞（KICH），肝臟肝細(xì)胞癌（LIHC）和膽管癌（CHOL），或結(jié)腸腺癌（COAD）和直腸腺癌（READ），通常被緊密地聚在一起（圖2A）。此外，作者還計(jì)算了兩個(gè)癌癥之間的相似性，即兩個(gè)癌癥中的PASEs的Jaccard指數(shù)。根據(jù)以共享PASEs的比例計(jì)算的相似性聚類，觀察到了類似的模式（圖2B）。這些結(jié)果與以前專注于表達(dá)和甲基化分析的研究一致，并表明相關(guān)的AS機(jī)制可能在具有類似組織來源的癌癥類型中運(yùn)作。接下來，作者調(diào)查了PASEs對癌癥特異性的貢獻(xiàn)程度。盡管大量的PASEs顯示出癌癥的特異性，但一些PASEs參與了許多癌癥類型（圖2C）。作者將這些AS事件定義為泛癌癥AS事件。這些泛癌差異性AS事件涉及到一些著名的致癌基因（如NFE2L2、RARA和SGK1）、腫瘤抑制基因（如CASP8、DNMT3A、FANCD2和SMARCA4）以及融合基因。這些泛PASEs中的大多數(shù)都與患者的生存期有關(guān)，它們在各種癌癥類型中的表現(xiàn)相似。作者接下來對這些泛癌基因進(jìn)行了功能富集分析。泛癌PASE參與的基因在一些癌癥相關(guān)的功能類別中富集（圖2D），如翻譯啟動，蛋白質(zhì)結(jié)合，以及參與細(xì)胞-細(xì)胞粘附。此外，這些基因在睪丸、K562和結(jié)直腸腺癌中表現(xiàn)出組織特異性高表達(dá)（圖2D）。綜上所述，這些結(jié)果意味著剪接異常通過調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)的途徑影響癌癥生物學(xué)。
擾動AS事件與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)
為了確定與癌癥中受干擾的PASEs相關(guān)的分子參與者，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)工作流程來識別RBP調(diào)節(jié)因子(圖3A)。首先將PSI與正常樣本進(jìn)行比較，構(gòu)建了每例患者的AS活動擾動譜?；谕换颊吒鰽S事件的擾動水平，計(jì)算出兩個(gè)活動評分(激活活動[SA]和抑制活動[SR])。其次，作者通過計(jì)算RBP的表達(dá)與AS活動評分的Spearman相關(guān)系數(shù)，確定了在癌癥中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄組干擾的RBP。
作者手工收集了2038個(gè)RBPs，并進(jìn)一步將它們分為九個(gè)群組（圖3B）。其中有139個(gè)核糖體蛋白，636個(gè)mRNAs和89個(gè)非編碼RNAs（ncRNAs）。接下來作者探討了RBP表達(dá)和AS擾動分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性。AS擾動分?jǐn)?shù)（SA或SR）較高的患者也可能表現(xiàn)出較高的疾病嚴(yán)重性（圖3C）。作者還比較了不同AS擾動分?jǐn)?shù)的患者的生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各種癌癥類型中，SA較高或SR較高的患者可能表現(xiàn)出較差的生存率。特別是KIRC和LIHC中SA或SR較高的患者，其生存期明顯較差（圖3D）。通過整合年齡、性別和腫瘤階段進(jìn)行了多變量分析。我們發(fā)現(xiàn)，在KIRC和LIHC中，AS擾動的水平是一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素。這些結(jié)果共同表明，AS擾動與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，其中普遍存在的PASEs的癌癥患者表現(xiàn)出更差的生存。
AS相關(guān)RBP調(diào)節(jié)因子的識別
AS活性評分的紊亂與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，作者假設(shè)其表達(dá)水平與這些評分相關(guān)的RBPs很可能在癌癥中調(diào)節(jié)AS。首先，作者確定了18種癌癥類型中差異表達(dá)的RBPs。分析發(fā)現(xiàn)更多的RBPs在癌癥中被上調(diào)（圖4A），作者還計(jì)算了這些RBPs差異表達(dá)的癌癥類型的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)更多的RBPs只在一種癌癥類型中觀察到（圖4B），這表明不同的癌癥類型有不同的RBP失調(diào)特征。此外，在分析的18種癌癥類型中，有一些持續(xù)失調(diào)的RBPs。作者確定了246個(gè)RBPs在超過15種癌癥類型中持續(xù)上調(diào)或下調(diào)。在這些RBPs中，APOBEC3B、DCN、EZH2和RAD51AP1在所有18種癌癥類型中都有差異表達(dá)。APOBEC3B在癌癥中起著關(guān)鍵作用，并被報(bào)道在許多癌癥中被上調(diào)。作為染色質(zhì)調(diào)控的主調(diào)控者，EZH2在人類上皮癌中被過度表達(dá)。大多數(shù)RBPs表現(xiàn)出持續(xù)的差異性表達(dá)。所有這些RBPs為確定癌癥的關(guān)鍵治療目標(biāo)提供了寶貴的資源。
作者接下來根據(jù)RBP表達(dá)和AS活性評分之間的相關(guān)性，確定了不同癌癥類型的AS事件的潛在RBP調(diào)節(jié)器。在18種癌癥中，總共確定了1365個(gè)與活性評分相關(guān)的RBPs（ActRBPs）和1045個(gè)與抑制評分相關(guān)的RBPs（ResRBPs）。在15種或更多的癌癥類型中觀察到211個(gè)ActRBPs和91個(gè)ResRBPs（圖4C和4D）。此外，MEX3A、MRVI1、PUS7、FHL1和SYNE1被確定為頂級ResRBPs，它們與18種癌癥類型的AS活性相關(guān)。MEX3A是一個(gè)干性相關(guān)的基因，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，而FHL1在癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制基因的功能，并被表觀遺傳信號所抑制。
泛癌RBP調(diào)節(jié)因子的功能
接下來，作者計(jì)算了每個(gè)RBP調(diào)節(jié)因子的癌癥類型數(shù)量，將RBP調(diào)節(jié)因子分為三種類型。僅發(fā)生于一種癌癥類型的RBPs被定義為癌癥特異性RBPs，在2-11種癌癥類型中發(fā)現(xiàn)的RBPs被定義為中度RBPs，在>11種癌癥中發(fā)現(xiàn)的RBPs被定義為泛癌癥RBPs(圖5A)。我們總共分別確定了302個(gè)和345個(gè)癌癥特異性ActRBPs和ResRBPs。泛癌ActRBPs和ResRBPs分別有71個(gè)和22個(gè)。這些泛癌癥RBPs可能調(diào)節(jié)不同癌癥類型的各種AS事件(圖5B)。特別是，ActRBP NME1和ResRBP SYNE1可能在癌癥中調(diào)節(jié)最多的AS事件。NME1是一種轉(zhuǎn)移抑制因子，可以在不影響原發(fā)腫瘤大小的情況下潛在地減少轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，NME1可能調(diào)節(jié)許多癌癥相關(guān)基因的AS，如CD44、CTNND、和PTBP2。這些結(jié)果表明，識別潛在的AS靶點(diǎn)提供了對RBP調(diào)節(jié)因子功能的見解。
為了研究這些泛癌RBPs的功能，作者接下來根據(jù)其調(diào)節(jié)的AS事件相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析。作者專注于50個(gè)癌癥標(biāo)志相關(guān)的通路。在錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01時(shí)，在93個(gè)RBPs和16個(gè)通路中發(fā)現(xiàn)了442個(gè)RBP-通路關(guān)聯(lián)（圖5C）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的泛癌RBPs都可能調(diào)節(jié)至少一個(gè)癌癥標(biāo)志相關(guān)通路。此外，有更多的RBPs參與有絲分裂紡錘體、紫外線反應(yīng)、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT-哺乳動物雷帕霉素（mTOR）靶向信號和脂肪生成。此外，作者發(fā)現(xiàn)RBPs在幾個(gè)與新陳代謝相關(guān)的通路中發(fā)揮了重要作用（圖5C）。事實(shí)上，越來越多的證據(jù)表明它們在新陳代謝中的作用。所有這些結(jié)果表明，泛癌RBPs通過調(diào)節(jié)AS事件在癌癥中發(fā)揮基本作用。
基于RBP的腎癌患者分層
越來越多的研究表明，AS事件能夠區(qū)分不同的癌癥亞型，而且對預(yù)后有影響。作者還發(fā)現(xiàn)，AS活動與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，特別是在腎癌中。因此，作者接下來確定了RBP調(diào)節(jié)器，并調(diào)查了它們是否有助于癌癥的分子亞型劃分。作者重點(diǎn)關(guān)注兩種類型的腎癌（KIRC和KIRP）。文章從這兩種癌癥類型中確定了68個(gè)共同的RBP調(diào)節(jié)器（圖6A）。接下來，根據(jù)這些RBPs的表達(dá)，將腎癌患者分成不同的亞型。進(jìn)行了一致性聚類，K值從2到10。這項(xiàng)分析顯示腎癌有四個(gè)亞型（圖6B）。C1、C2、C3和C4亞型中分別有298、76、426和26名患者。調(diào)查這些患者的來源，發(fā)現(xiàn)C1、C2和C4的大多數(shù)患者是KIRC。然而，C3亞型同時(shí)包括KIRC和KIRP患者。此外，作者還探討了不同亞型患者的臨床信息。發(fā)現(xiàn)C4型的患者被診斷的年齡明顯較?。▓D6C）。在所有亞型中，C2亞型患者的年齡最高。作者還計(jì)算了高分期（iii和iv）和低分期（i和ii）患者的比例。C2和C4的高分期患者多于C1和C3（圖6D）。這些結(jié)果表明，C4的病人可能更嚴(yán)重，所以作者進(jìn)一步調(diào)查了他們的生存率。發(fā)現(xiàn)C4的病人生存率最差（圖6E）。此外，C1的病人比C3的病人有更好的生存率。C2的患者也比C4的患者有更好的生存率。這些結(jié)果表明，常見的RBP調(diào)節(jié)器有助于識別癌癥的分子亞型。
腎癌亞型的不同癌癥通路
作者接下來調(diào)查了不同腎癌亞型的通路活動的差異程度。首先，GSVA分析計(jì)算了所有患者的50條癌癥標(biāo)志相關(guān)的通路活性。接下來，通過方差分析（ANOVA）比較通路活性的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些通路中的80%（40/50）在C1-C4亞型中表現(xiàn)出不同的通路活性（圖7A）。特別是，C2和C4患者的通路活性明顯高于C1和C3亞型的患者（圖7B）。這些結(jié)果與C2和C4亞型患者的生存率較差是一致的。雖然C1和C3的患者之間，以及C2和C4的患者之間通路活性相似，但這幾組之間存在明顯的生存差異（圖6E）。作者還發(fā)現(xiàn)，膽汁酸代謝途徑在C1和C2亞型中顯示出更大的活性（圖7C），這可能是區(qū)分C1與C3、C2與C4亞型的潛在通路指標(biāo)。膽汁酸在調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝方面起著關(guān)鍵作用。此外，作者還調(diào)查了患者的免疫細(xì)胞浸潤水平。C1患者顯示出較高的免疫細(xì)胞浸潤水平。作者還探討了不同亞型中患者的突變情況?？偣舶l(fā)現(xiàn)有五個(gè)基因在亞型中具有明顯的突變頻率。這些基因已被發(fā)現(xiàn)在癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如VHL52和PBRM153。根據(jù)RBPs調(diào)控的AS事件，作者又將患者分為三個(gè)亞型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些集群與基于RBP表達(dá)的分類明顯重疊。接下來，作者在另兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了該分類。綜上所述，癌癥亞型之間的通路活動存在著明顯的差異，這為基于通路的癌癥治療提供了潛在的候選方案。
腫瘤中RBP的治療靶點(diǎn)
失調(diào)的RBPs可以影響癌癥的許多特征，這表明RBPs可能是癌癥治療的一個(gè)很好的治療靶點(diǎn)。接下來，為了確定癌癥治療的潛在RBP候選者，作者評估了不同癌癥類型的RBPs表達(dá)水平和藥物活性之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在10種癌癥中，有1,088個(gè)RBPs與藥物半數(shù)最大抑制濃度（IC50）值相關(guān)（圖8A）。作者關(guān)注KIRC中藥物-RBP的相關(guān)性，這些相關(guān)的RBP和藥物形成了一個(gè)密集的網(wǎng)絡(luò)（圖8B）。具體來說，作者發(fā)現(xiàn)幾種藥物，如培利替尼、馬西替尼和奧米帕利西布，與更多的RBPs相關(guān)。佩利替尼是一種有效的不可逆的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，目前正在進(jìn)行治療癌癥的臨床試驗(yàn)。此外，一些RBPs，如ATP5F1、BCAS2和RRP12，也與更多的藥物相關(guān)。這些RBPs已被證明在各種類型的癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，作者提取了68個(gè)用于腎癌分型的RBP的子網(wǎng)絡(luò)。10種藥物可能與5種RBP的表達(dá)相關(guān)(圖8C)，包括SNRPD1、RNPS1、PPIA、MRPL14和PPIH。PPIH的表達(dá)與masitinib和QL-XII-47相關(guān)。接下來，作者通過將細(xì)胞系分為兩組來計(jì)算模擬RBP表達(dá)的改變。然后比較了RBP表達(dá)不同的兩組之間的IC50值，發(fā)現(xiàn)了顯著的組間差異。這些結(jié)果表明，RBP表達(dá)的改變可能影響細(xì)胞系的IC50。此外，PPIH高表達(dá)與較差的腎癌總生存率和無病生存率顯著相關(guān)(圖8 D)。這些結(jié)果提示這兩種藥物有可能用于癌癥治療。
總之，本文對AS擾動景觀的綜合分析確定了RBPs為癌癥的潛在治療目標(biāo)。作者提出了一種識別RBP調(diào)節(jié)因子的計(jì)算流程。通過泛癌癥分析發(fā)現(xiàn)了一些保守的RBP調(diào)節(jié)因子。分析表明RBP調(diào)節(jié)因子的表達(dá)有助于癌癥亞型的分型，并為RBPs在癌癥中的調(diào)節(jié)功能提供了新的見解。
Li J, Pan T, Chen L, Wang Q, Chang Z, Zhou W, Li X, Xu G, Li X, Li Y, Zhang Y. Alternative splicing perturbation landscape identifies RNA binding proteins as potential therapeutic targets in cancer. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Apr 9;24:792-806. doi: 10.1016/j.omtn.2021.04.005 . PMID: 33996260; PMCID: PMC8099609.
