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今天給大家分享一篇華西醫(yī)院乳腺臨床研究中心劉小偉團(tuán)隊(duì)2023年1月26日發(fā)表在Cancer Cell（IF:38.585）上的文章：Immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A mediates evasion of circulating tumor cells from NK cell surveillance。文章主要介紹了人胰腺導(dǎo)管腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）和自然殺傷細(xì)胞（NK）通過免疫檢查點(diǎn)分子與HLA-E: CD94-NKG2A相互作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。
一．研究背景以及研究方法
目前，在實(shí)體腫瘤的原發(fā)或轉(zhuǎn)移小生境中，腫瘤細(xì)胞與不同類型的免疫細(xì)胞之間的免疫檢查點(diǎn)分子對已經(jīng)得到了廣泛的研究。然而，對循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測研究較少。由于血液循環(huán)是腫瘤從原始位點(diǎn)向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的主要途徑，對血液中腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用的研究可能提供一種通過激活宿主免疫消除系統(tǒng)來阻斷轉(zhuǎn)移的策略。作者團(tuán)隊(duì)主要研究（1）在循環(huán)中移動的腫瘤細(xì)胞是否會受到免疫細(xì)胞的攻擊;（2）哪種類型的免疫細(xì)胞具有免疫消除功能;（3）循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）如何通過抑制免疫檢查點(diǎn)對逃脫這種免疫監(jiān)視。
借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究者在單細(xì)胞精度上描繪了人胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）的CTC、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病變的轉(zhuǎn)錄組圖譜。體外和體內(nèi)的細(xì)胞相互作用分析和功能實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，CTC和自然殺傷細(xì)胞(NK)通過免疫檢查點(diǎn)分子對HLA-E:CD94-NKG2A相互作用介導(dǎo)免疫逃逸。通過阻斷NKG2A或抑制HLA-E表達(dá)來破壞這種相互作用可以增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的體外腫瘤細(xì)胞殺傷，并在體內(nèi)防止腫瘤轉(zhuǎn)移。機(jī)制研究表明，血小板源性RGS18通過AKT-GSK3β-CREB信號通路促進(jìn)HLA-E表達(dá)，RGS18過表達(dá)促進(jìn)胰腺腫瘤肝轉(zhuǎn)移?？偠灾“鍋碓吹腞GS18通過參與免疫檢查點(diǎn)HLA-E:CD94-NKG2A協(xié)助CTC逃脫NK介導(dǎo)的免疫監(jiān)測。免疫檢查點(diǎn)HLA-E:CD94-NKG2A信號的阻斷可以通過免疫殺傷消除CTC進(jìn)而來防止體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。
二．研究結(jié)果
1、PDAC 中CTC、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
通過10X單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)獲得原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤活檢以及CTC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜(圖1A)。嚴(yán)格質(zhì)控之后，共獲得74,206個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其中27,296個(gè)細(xì)胞來自原發(fā)腫瘤，36,922個(gè)細(xì)胞來自肝轉(zhuǎn)移瘤，9,988個(gè)細(xì)胞來自HPV血液(圖1B和1C)。
作者結(jié)合單細(xì)胞RNA測序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)以及經(jīng)典標(biāo)記基因并定義細(xì)胞群PTPRC- (CD45-) 細(xì)胞定義為上皮細(xì)胞 (EPCAM+，KRT8+， KRT18+，KRT19+)，成纖維細(xì)胞 (FAP+，COL1A1+，DCN+)，內(nèi)皮細(xì)胞(VWF+，CDH5+，ENG+，PECAM1+)。PTPRC+ (CD45+) 細(xì)胞進(jìn)一步定義為B細(xì)胞 (CD79A+，CD79B+，MS4A1+)，髓系細(xì)胞 (AIF1+，CD14+，LYZ+，F(xiàn)PR1+)， NK細(xì)胞 (KLRF1+，KLRD1+，GNLY+) 和T細(xì)胞(CD3D+，CD3E+，CD3G+)。CTC由標(biāo)記基因 (PTPRC-，PPBP+，PF4+，CD9+，KRT8+，TIMP1+)，以及采用CopyKT算法進(jìn)行拷貝數(shù)變異(CNV)驗(yàn)證(圖1C)。經(jīng)過嚴(yán)格篩選，共鑒定出523個(gè)CTC。
2. CTC、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征
差異基因表達(dá)分析顯示大量血小板相關(guān)基因在CTC中顯著富集，而在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞中不富集 (圖1D)。有趣的是，CTC中過表達(dá)最多的100個(gè)基因中，有32個(gè)被鑒定為血小板相關(guān)基因。作為典型特征，在CTC中觀察到EMT相關(guān)基因上調(diào)和上皮基因丟失 (圖1D)。此外，GPCR家族基因RGS18、NRGN、GNG11、CCL5等在CTC中表達(dá)顯著上調(diào)，而核糖體相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)。
CluGO生物學(xué)通路分析結(jié)果表明CTC特異性上調(diào)了一些通路，包括免疫相關(guān)、血小板相關(guān)、致癌、細(xì)胞周期、凋亡、代謝、EMT、RNA和生物合成等信號通路 (圖1E)。更重要的是，與原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤相比，CTC中的免疫相關(guān)特征更活躍，這意味著CTC與循環(huán)中的免疫細(xì)胞之間可能存在潛在的相互作用(圖1E)。這種相互作用反映了來自宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和CTC的免疫逃逸，很大程度上決定了CTC在轉(zhuǎn)移過程中的命運(yùn)。
(A) PDAC轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)方案
(B) t-SNE圖展示所注釋的細(xì)胞類型 (n = 18個(gè)樣本，74,206個(gè)細(xì)胞)
(C) t-SNE圖分別顯示原發(fā)腫瘤、血液和轉(zhuǎn)移灶腫瘤的細(xì)胞類型
(D) CTC與腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)的30個(gè)上調(diào)/下調(diào)基因
(E) CTC和原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性病變腫瘤細(xì)胞之間差異富集的信號通路
3. PDAC轉(zhuǎn)移過程中的免疫監(jiān)測
為了描述CTC的特異性免疫逃逸相關(guān)行為，作者對所有CD45+ 免疫細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)分亞群分析 (圖2A和2B)。根據(jù)典型標(biāo)記物，免疫細(xì)胞可進(jìn)一步分為8種淋巴細(xì)胞亞型，包括NK細(xì)胞 (KLRD1+，KLRF1+)，NK-T細(xì)胞(CD3D+，CD3E+，KLRD1+，KLRF1+)，CD8耗竭T細(xì)胞 (CD8A+， PDCD1+，LAG3+)，CD8效應(yīng)T細(xì)胞 (CD8A+，IFNG+，GZMA+)，記憶T細(xì)胞(CD3D+，CD44+，IL7R+，LTB+)，na?ve T細(xì)胞(CD3D+，CCR7+，TCF7+，SELL+，LEF1+)，Treg細(xì)胞(FOXP3+，IL2RA+) 和B細(xì)胞(CD79A+， CD79B+)。此外還包括七個(gè)髓系細(xì)胞亞型，即中性粒細(xì)胞 (CD14-，F(xiàn)CGR3B+，F(xiàn)PR1+)，單核細(xì)胞 (CD14+，S100A12+，F(xiàn)CGR3A+)，M1型巨噬細(xì)胞 (FCGR3A+， CD68+，ITGAX+，ITGAM+)，M2型巨噬細(xì)胞 (CD163+，MRC1+，MSR1+)，經(jīng)典樹突狀細(xì)胞 (cDC; CD1C+，F(xiàn)CER1A+，CLEC10A+)，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 (pDC; LILRA4+，IL3RA+)和肥大細(xì)胞(MS4A2+，TPSAB1+，KIT+) (圖2C)。
作者用CellPhoneDB研究了腫瘤細(xì)胞表面配體-受體對和各亞型免疫細(xì)胞的分子相互作用。在原發(fā)灶、循環(huán)擴(kuò)散階段和轉(zhuǎn)移灶中，發(fā)現(xiàn)了不同的免疫相關(guān)配體-受體對，這意味著腫瘤轉(zhuǎn)移過程中免疫監(jiān)測的動態(tài)變化(圖2D-2F)。在原發(fā)/轉(zhuǎn)移病灶的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與多種類型的免疫細(xì)胞如CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等之間存在復(fù)雜而密集的相互作用，而腫瘤-免疫在血液循環(huán)中的相互作用相對簡單，主要觀察到CTCs和NK細(xì)胞之間具有較強(qiáng)的相互作用(圖2E)。
隨后，對免疫檢查點(diǎn)的配受體對進(jìn)行表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移灶中相互作用的分子對具有相當(dāng)大的相似性(圖2G)。在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病變中，腫瘤細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的共抑制或共刺激相互作用，例如LAGLS9-HAVCR2、TIGIT-PVR和TIGIT-NECTIN2/3，這意味著PDAC可能是一種潛在的免疫治療策略(圖2G)。
值得注意的是，在循環(huán)中的CTC和免疫細(xì)胞之間觀察到一種獨(dú)特的免疫檢查點(diǎn)分子對模式(圖2G)。在這些相互作用的分子對中，HLA-E和CD94-NKG2s被認(rèn)為是CTC和NK細(xì)胞之間最強(qiáng)烈的免疫相互作用，在正向(NK→CTC:CD94-NKG2A:HLA-E, CD94-NKG2C:HLA-E, CD94-NKG2E:HLA-E)和反向(CTC→NK:HLA-E:KLRC1, HLA-E:KLRC2, HLA-E:KLRK1)。進(jìn)一步解析表明，NKG2A、NKG2C、NKG2D和NKG2E都可能介導(dǎo)這種相互作用。先前的研究表明，CD94-NKG2A異源二聚體作為一種抑制性免疫檢查點(diǎn)分子，比其他NKG2亞型發(fā)揮主要作用。當(dāng)NKG2A水平較高時(shí)，NKG2C-E的功能可能被抑制。并且觀察到，HLA-E在CTC上的表達(dá)水平高于實(shí)體病變腫瘤細(xì)胞(圖2H-2J)。因此，NKG2A和HLA-E之間的相互作用上調(diào)可能是由HLA-E分子水平的增加引起的。CTCs上HLA-E的上調(diào)和NK細(xì)胞上CD94-NKG2A的特異性表達(dá)模式為它們的相互作用提供了基礎(chǔ)(圖2K)。
(A) t-SNE圖展示所有免疫細(xì)胞亞型組成
(B) t-SNE圖顯示所有免疫細(xì)胞的組織來源
(C)熱圖展示各亞型免疫細(xì)胞中標(biāo)記基因的表達(dá)
(D-F) 原發(fā)腫瘤(D)、血液 (E)和轉(zhuǎn)移腫瘤(F)中腫瘤細(xì)胞/ CTC和免疫細(xì)胞之間相互作用
(G)腫瘤細(xì)胞/ CTC與免疫細(xì)胞之間的免疫檢查點(diǎn)相關(guān)配體-受體對
(H-J) HLA-E在CTC和腫瘤細(xì)胞上的相對表達(dá)水平
(K) CD94(KLRD1)和NKG2A(KLRC1)在血液免疫細(xì)胞中的相對表達(dá)水平
(L)多重免疫熒光驗(yàn)證血液中相互作用的CTC細(xì)胞與NK細(xì)胞
4. CTC通過免疫檢查點(diǎn)HLA-E:CD94-NKG2A逃避NK細(xì)胞的監(jiān)測
NK細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明HLA-E的過表達(dá)可以保護(hù)PDAC SU86.86細(xì)胞免受NK細(xì)胞的殺傷(圖3A)。使用特異性抗體單抗阻斷NKG2A可在HLA-E過表達(dá)存在或不存在的情況下增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。類似地，抑制PDAC的HLA-E表達(dá)可有效地提高NK細(xì)胞殺傷性。Western blot結(jié)果顯示，典型的免疫檢查點(diǎn)信號SHP-1被抑制，而功能酶GZMB在與HLA-E缺陷腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)分離的NK細(xì)胞中上調(diào)(圖3B)。
為了在體內(nèi)驗(yàn)證這種免疫檢查點(diǎn)功能，作者通過動物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(圖3C)，結(jié)果表明，抗NKG2A阻斷抗體能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，且具有時(shí)間依賴性(圖3D和3E)。越早阻斷NKG2A，越能有效預(yù)防轉(zhuǎn)移。在接種腫瘤前阻斷NKG2A可顯著防止腫瘤轉(zhuǎn)移，而在0天和1天啟動的阻斷僅部分阻礙腫瘤轉(zhuǎn)移。第3天(第3和第5天)后，NKG2A阻斷不再能阻止轉(zhuǎn)移。通過腫瘤淋巴結(jié)計(jì)數(shù)和H&E染色進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果(圖3F-3H)。
與NKG2A抗體阻斷的結(jié)果一致，生物熒光定量、腫瘤淋巴結(jié)計(jì)數(shù)、H&E染色病結(jié)果均顯示H2-T23 (HLA-E)下調(diào)可明顯緩解肺轉(zhuǎn)移(圖3I-3M)。為了驗(yàn)證這一免疫檢查點(diǎn)分子對的魯棒性，作者通過讓具有免疫功能的小鼠C57/BL6作為受體來重復(fù)功能驗(yàn)證(圖3N)。通過定量評估接種后15天熒光素酶陽性轉(zhuǎn)移，作者發(fā)現(xiàn)NKG2A阻斷和H2-T23下調(diào)平均分別減輕了63倍和115倍的肺轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)分析肺解剖結(jié)果顯示，與空白載體的對照組相比，NKG2A阻斷和H2-T23下調(diào)明顯減輕了轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HLA-E:CD94-NKG2A在血液循環(huán)轉(zhuǎn)移過程中的免疫檢查點(diǎn)功能。在另一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中，Kaplan-Meier估計(jì)結(jié)果顯示，阻斷NKG2A和抑制H2-T23均可顯著提高肺轉(zhuǎn)移小鼠在接種腫瘤后27天的總生存率(圖3O)。
(A)評估NK細(xì)胞對PDAC SU86.86細(xì)胞的細(xì)胞毒性
(B)檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)酶GZMB和免疫檢查點(diǎn)相關(guān)激酶SHP1
(C)Balb/c裸鼠靜脈接種KPC-Luc細(xì)胞，并在指定時(shí)間點(diǎn)(-1、0、1、3和5天)開始NKG2A阻斷治療
(D和E)在靜脈接種KPC-Luc細(xì)胞15天后，通過生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察(D)和定量(E)肺轉(zhuǎn)移
(F和G)對肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行拍照(F)和定量(G)
(H)用H&E染色評估 (D)的肺病理結(jié)果
(I-L)注射H2-T23敲除KPC-Luc細(xì)胞的Balb/c裸鼠肺轉(zhuǎn)移的生物發(fā)光圖像(I)和定量(J)。計(jì)數(shù)肺腫瘤中腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)(K)，顯示代表性圖像(L)
(M)用H&E染色評估(I)肺的肺病理結(jié)果
(N)在靜脈接種KPC-Luc細(xì)胞15天后，使用生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察轉(zhuǎn)移到肺的KPC-Luc細(xì)胞。C57BL/6小鼠接種前1天用抗NKG2A抗體阻斷或靜脈移植H2-T23 (HLA-E)敲除的KPC-Luc細(xì)胞
(O) Kaplan-Meier圖顯示KPC-Luc細(xì)胞接種小鼠經(jīng)指示治療后的總生存率
5. RGS18通過AKT-GSK3β-CREB1軸上調(diào)CTC上的HLA-E
為了闡明CTC調(diào)節(jié)HLA-E表達(dá)的具體機(jī)制，作者評估了與HLA-E表達(dá)水平潛在正相關(guān)的差異表達(dá)基因 (圖2H)。作者團(tuán)隊(duì)篩選出一系列HLA-E相關(guān)基因，包括PPBP、PF4、NRGN 和RGS18等(圖4A)。將這些基因?qū)雰煞NPDAC細(xì)胞系SU86.86和CFPAC-1后，HLA-E表達(dá)水平上調(diào)。其中RGS18最強(qiáng)(圖4B)。為了驗(yàn)證RGS18在CTC中的上調(diào)，作者通過免疫熒光染色檢測了所有6例接受scRNA-seq的患者活檢組織中的RGS18蛋白。RGS18幾乎只在CTC中表達(dá)，而不是在原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(圖4C)。
然后，作者探討了RGS18對HLA-E表達(dá)的調(diào)節(jié)。作為R4亞家族蛋白，RGS18通過Gαi和Gαq負(fù)調(diào)控GPCR信號通路。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測了RGS18過表達(dá)的PDAC細(xì)胞中潛在的下游通路。通過檢測關(guān)鍵激酶的磷酸化，作者發(fā)現(xiàn)AKT通路被RGS18過表達(dá)特異性地干擾(圖4D)。
RGS18上調(diào)后，AKT磷酸化下調(diào)。隨后，GSK3β通過抑制絲氨酸殘基9磷酸化而穩(wěn)定(圖4D)。然后GSK3β通過磷酸化絲氨酸殘基129來增強(qiáng)CREB1的活性。被激活的CREB1顯示出細(xì)胞核優(yōu)先亞細(xì)胞定位模式(圖4E)。在細(xì)胞核中，CREB1與RFX和NFY形成轉(zhuǎn)錄正調(diào)控復(fù)合物，結(jié)合HLA-E的啟動子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由完整的SXY模塊和不完整的增強(qiáng)子A和ISRE位點(diǎn)組成。結(jié)果顯示RGS18過表達(dá)上調(diào)了三種PDAC細(xì)胞系中HLA-E的水平(圖4D)。與這些結(jié)果一致，CREB1的下調(diào)顯著下調(diào)HLA-E的表達(dá)(圖4F)。相反，在SU86.86和CFPAC-1細(xì)胞中敲除RGS18可增強(qiáng)AKT的磷酸化并破壞GSK3β的穩(wěn)定。隨后，它使CREB1失活并下調(diào)HLA-E表達(dá)(圖4D)。此外，通過兩個(gè)活化突變體AKTE17K和AKTQ79K在PDAC細(xì)胞中激活A(yù)KT信號，抑制GSK3β，下調(diào)CREB1，進(jìn)而降低HLA-E的表達(dá)(圖4G)。綜上所述，信號通路研究表明RGS18通過AKT- GSK3β-CREB1軸促進(jìn)HLA-E的表達(dá)。
為了驗(yàn)證RGS18的促轉(zhuǎn)移功能，作者通過脾內(nèi)注射熒光素酶標(biāo)記的SU86.86 PDAC細(xì)胞和人NK細(xì)胞，總結(jié)了HPV肝轉(zhuǎn)移的過程(圖5A)。生物發(fā)光圖像和信號定量顯示，在接種過表達(dá)RGS18的SU86.86細(xì)胞的小鼠中，肝轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝臟的解剖位置(圖5B和5C)。相反，空白載體SU86.86細(xì)胞接種對照組小鼠，未見明顯肝轉(zhuǎn)移。通過檢查解剖的肝臟器官，作者在接種了人RGS18 (hRGS18)過表達(dá)PDAC細(xì)胞的小鼠中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性腫瘤，而在對照組中沒有發(fā)現(xiàn)(圖5D)。H&E染色和免疫組化檢測EpCAM和RGS18進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖5E)。在另一項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，RGS18過表達(dá)顯著降低了肝轉(zhuǎn)移小鼠的總生存率(圖5F)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證RGS18是否通過促進(jìn)NK細(xì)胞的免疫逃逸來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，作者進(jìn)行了肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與肝轉(zhuǎn)移相似，生物發(fā)光成像和信號定量結(jié)果顯示mRGS18通過上調(diào)H2-T23顯著促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移(圖5G, 5H)。在腫瘤接種前1天注射4劑NKG2A阻斷抗體可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤淋巴結(jié)計(jì)數(shù)和H&E染色進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖5I-5K)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明RGS18通過上調(diào)CTC中抑制性免疫檢查點(diǎn)HLA-E在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
(A)三維散點(diǎn)圖顯示CTCs中與HLA-E表達(dá)水平相關(guān)的差異表達(dá)基因
(B)在SU86.86和CFPAC-1中檢測HLA-E表達(dá)水平，PPBP、PF4、NRGN或RGS18過表達(dá)。
(C)通過多重免疫熒光圖像顯示CTC和患者匹配的原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性腫瘤中的RGS18
(D)在SU86.86和CFPAC-1細(xì)胞中分別檢測到RGS18過表達(dá)(左)或敲低(右)的AKT-GSK3β-CREB通路活性蛋白和HLA-E。
(E)通過免疫熒光染色可見過表達(dá)RGS18的PDAC細(xì)胞中p-CREB1的亞細(xì)胞分布
(F) western blot檢測CREB1敲除的SU86.86和CFPAC-1細(xì)胞中HLA-E和CREB1蛋白的表達(dá)
(G)在過表達(dá)AKTQ79K或AKTE17K突變體的SU86.86中檢測AKT- GSK3β-CREB通路活性和HLA-E水平
(A)解剖圖顯示PDAC肝轉(zhuǎn)移模型的建立，通過半脾注射SU86.86-Luc細(xì)胞
(B和C)接種14天后，使用生物發(fā)光成像系統(tǒng)對肝轉(zhuǎn)移進(jìn)行可視化(B)和定量(C)。
(D)按(A)所述治療的小鼠中解剖的肝轉(zhuǎn)移腫瘤
(E)通過H&E和IHC染色人EpCAM和RGS18評估PDAC肝轉(zhuǎn)移
(F) Kaplan-Meier圖顯示PDAC肝轉(zhuǎn)移小鼠的總生存期
(G-J)采用小鼠RGS18過表達(dá)或不表達(dá)的KPC-luc尾靜脈注射建立KPC肺轉(zhuǎn)移模型。使用生物發(fā)光成像系統(tǒng)對肺轉(zhuǎn)移性KPC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行可視化(G)和定量(H)。統(tǒng)計(jì)肺內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)(I)，顯示代表性圖像(J)
(K)用H&E染色評價(jià)(G)的肺病理結(jié)果
6. CTC通過吸收血小板獲得RGS18
眾所周知，CTC通常被血小板覆蓋，血小板是RGS18蛋白的主要來源。除RGS18外，CTC的scRNA-seq數(shù)據(jù)中還特異性觀察到PPBP、PF4等血小板相關(guān)基因 (圖1D)。因此，作者推測CTC中的RGS18可能來源于粘附血小板，通過共聚焦顯微鏡，他們發(fā)現(xiàn)血小板不僅在的CTC細(xì)胞表面上，而且在CTC細(xì)胞中存在(圖6A)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞與WGA-Alexa594預(yù)先標(biāo)記的患者來源的血小板孵育時(shí)，觀察到腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的熒光信號(圖6B)。并且流式細(xì)胞術(shù)對熒光信號的定量進(jìn)一步表明，患者來源的血小板被腫瘤細(xì)胞以劑量依賴的方式內(nèi)化(圖6C)。然后，研究人員用小鼠PDAC細(xì)胞系KPCs孵育人血小板，并通過特定引物的實(shí)時(shí)qPCR檢測供體(人)和宿主(小鼠)RGS18的mRNA水平。結(jié)果表明，人類RGS18的mRNA以劑量依賴的方式上調(diào)，而不是小鼠RGS18(圖6D)。從PDAC患者分離的血小板孵育后，在SU86.86和CFPAC-1中，RGS18和HLA-E水平均以劑量依賴方式上調(diào)(圖6E)。綜上所述，結(jié)果表明CTC獲得血小板來源的RGS18, RGS18通過AKT- GSK3β-CREB信號通路上調(diào)HLA-E的表達(dá)(圖7)。上調(diào)的HLA-E與NK細(xì)胞上的CD94-NKG2A相互作用，作為免疫檢查點(diǎn)對抑制循環(huán)中對CTC的免疫監(jiān)測。
(A)用免疫熒光標(biāo)記將CTC與血小板標(biāo)記物共染色
(B)用WGA594預(yù)標(biāo)記PDAC患者血小板的細(xì)胞內(nèi)定位
(C)孵育24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)化WGA594預(yù)標(biāo)記血小板的SU86.86和CFPAC-1細(xì)胞
(D) qPCR檢測人RGS18和小鼠RGS18相對mRNA表達(dá)量
(E) western blot檢測PDAC患者血小板處理72 h后SU86.86和CFPAC-1細(xì)胞中HLA-E、RGS18和CD41蛋白水平
四、總結(jié)
在這里，研究者報(bào)道了HLA-E和CD94-NKG2A之間的直接相互作用作為一個(gè)免疫檢查點(diǎn)，它負(fù)向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞對CTC的免疫清除。因此，阻斷HLA-E:CD94-NKG2A可以通過激活NK細(xì)胞消除CTC的功能來防止腫瘤轉(zhuǎn)移。值得注意的是，該方案可能對原發(fā)性或已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤都沒有高療效，因?yàn)镠LA-E:CD94-NKG2A在實(shí)性病變中的表達(dá)相對較低(圖2G)。這些結(jié)果可能部分解釋了目前單藥抗CD94抗體(NCT02459301, NCT02331875, NCT02557516)臨床試驗(yàn)中不滿意的結(jié)果。此外，在作者納入的所有胰腺癌病例中都觀察到缺乏PD-1:PD-L1相互作用，說明抗PD-1或PD-L1方案在這類惡性腫瘤中的療效較差。作者的結(jié)果還表明，阻斷HLA-E:CD94-NKG2A或采用缺乏CD94/NKG2A的CAR-NK細(xì)胞可能是預(yù)防CTC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的有前景的策略，特別是在大量的CTC釋放到血液中的情況下，例如實(shí)體瘤的手術(shù)切除。
小編認(rèn)為這是一個(gè)研究癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制很好的一個(gè)范例，從中找到輔助腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的“幫手”，進(jìn)而通過阻斷相互作用，達(dá)到緩解腫瘤轉(zhuǎn)移的目的，大家如果感興趣，是不是可以換個(gè)癌種試試呢！
