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大家好！今天給大家分享的文獻(xiàn)是2022年1月發(fā)表在Cancer Cell（IF=31.74）上的文章。前期基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已揭示肝內(nèi)膽管癌的遺傳圖譜，多組學(xué)的發(fā)展，包括蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合基因組學(xué)，闡明了新的疾病亞型和信號(hào)通路，并發(fā)現(xiàn)了癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，這種多組學(xué)策略可能有助于揭示新的機(jī)制和確定新的靶點(diǎn)，為肝內(nèi)膽管癌患者提供額外的治療選擇。這篇文章就是蛋白質(zhì)基因組學(xué)水平上確定了肝內(nèi)膽管癌的新亞型。
Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma
蛋白基因組學(xué)的特征確定了肝內(nèi)膽管癌的臨床相關(guān)亞群
文章思路：
摘要圖片
摘要：作者利用262例患者配對(duì)的腫瘤和鄰近肝組織對(duì)肝內(nèi)膽管癌（iCCA）進(jìn)行了蛋白基因組學(xué)測(cè)定。整合的蛋白基因組學(xué)分析優(yōu)先分析了遺傳變異并揭示了iCCA發(fā)病機(jī)制。黃曲霉毒素特征與腫瘤發(fā)生、增殖和免疫抑制有關(guān)。突變相關(guān)信號(hào)特征顯示TP53和KRAS共突變可能通過(guò)整合素-FAK-SRC通路促進(jìn)iCCA轉(zhuǎn)移。FGFR2融合激活Rho GTPase通路并可能是新生抗原的潛在來(lái)源。蛋白基因組學(xué)分析識(shí)別出4個(gè)亞群（S1-S4），并具有特異性的生物標(biāo)志物。這些亞群在預(yù)后、基因變異、微環(huán)境失調(diào)、腫瘤微生物組成和潛在治療方面具有顯著特征。SLC16A3和HKDC1被進(jìn)一步鑒定為與iCCA細(xì)胞代謝重編程相關(guān)的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究為進(jìn)一步確定iCCA的分子發(fā)病機(jī)制和治療機(jī)會(huì)提供了寶貴資源。
結(jié)果：
1.中國(guó)人群iCCA的蛋白基因組學(xué)圖譜
作者對(duì)262例iCCA患者的遺傳譜和相關(guān)臨床病理特征進(jìn)行了分析（圖1A）。最終確定了復(fù)旦大學(xué)人群（FU-iCCA）、MSKCC和ICGC中8個(gè)顯著突變的基因突變頻率（圖1B）。FU-iCCA人群與其他已發(fā)表的iCCA人群之間的突變特征進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素特征在7.1% FU-iCCA人群和9.7%的Zou等人的研究中存在，這兩組研究對(duì)象均為中國(guó)人群，但在三個(gè)西方人群中均不存在。馬兜鈴酸（AA）也有這種類似的趨勢(shì)（圖1C）。比較有明顯黃曲霉毒素特征、馬兜鈴酸特征和其他特征的iCCA人群腫瘤TMB和腫瘤新抗原時(shí)發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素和AA特征的樣本TMB和新抗原載量顯著升高（圖1D）。通過(guò)比較所有具有或不具有黃曲霉毒素特征的腫瘤的多組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)具有黃曲霉毒素特征的腫瘤表現(xiàn)出DNA修復(fù)和細(xì)胞周期通路上調(diào)，凋亡、感染炎癥和免疫通路下調(diào)（圖1E）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TP53突變，尤其是R249S突變與黃曲霉毒素特征顯著相關(guān)（圖1F和1G）。
圖1 FU-iCCA人群基因組圖譜
2.體細(xì)胞拷貝數(shù)變異的多組學(xué)分析
拷貝數(shù)變異（CNAs）對(duì)mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白豐度有順式和反式的影響（圖2A）。mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白分別觀察到3981、1081和408個(gè)顯著的順式相關(guān)性，在3個(gè)組學(xué)中只有194個(gè)顯著的順式效應(yīng)（圖2B）?？偣灿?63個(gè)蛋白質(zhì)同時(shí)顯示了CNA-mRNA和CNA-蛋白順式效應(yīng)，這些效應(yīng)主要富集在代謝、生物合成和蛋白質(zhì)加工途徑中（圖2C）。在前10個(gè)反式效應(yīng)的癌癥基因普查（cancer gene census, CGC）中MDM4擴(kuò)增與免疫治療超進(jìn)展有關(guān)（圖2D）。在染色體1p和14q中，顯示出最多反式效應(yīng)的基因?yàn)镃NA-蛋白質(zhì)和CNA-mRNA（圖2A）。值得注意的是，14q缺失顯示出與全蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組豐度的差異相關(guān)（圖2E），提示這些區(qū)域可能存在蛋白質(zhì)水平的調(diào)控。對(duì)于蛋白質(zhì)豐度隨14q缺失增加的585個(gè)基因，富集分析揭示了它們與剪接體、錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期和代謝有關(guān)（圖2F）。此外，14q缺失對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)有順式和反式的影響，而不是mRNA表達(dá)（圖2G）?？傊?，14q相關(guān)的順式和反式的缺失可能為iCCA的腫瘤發(fā)生提供機(jī)制基礎(chǔ)（圖2H）。
圖2 拷貝數(shù)變異對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)豐度的影響
3.體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)基因突變的蛋白質(zhì)基因組關(guān)聯(lián)性分析
TP53突變與細(xì)胞周期、藥物代謝、吞噬體和碳代謝通路上調(diào)有關(guān)，也與ECM黏著斑、PI3K-AKT和Hippo-YAP信號(hào)通路下調(diào)有關(guān)（圖3A）。KRAS突變與炎癥-感染和ECM黏著斑信號(hào)通路中的蛋白增加有關(guān)，與細(xì)胞周期中的蛋白減少有關(guān)（圖3B）。有趣的是，作者選用的人群中10/215名iCCA患者存在TP53和KRAS共突變，且生存率明顯低于TP53或KRAS單突變患者（圖3C），這表明它們有獨(dú)特的分子特征。細(xì)胞黏附相關(guān)分子ITGA6、ITGB4、ITGB6、CDH3和CLDN18在TP53Mut和KRASmut腫瘤中表達(dá)量最高（圖3D和3E）。TP53Mut和KRASmut腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率最高（40%），因此TP53、KRAS共突變可能通過(guò)整合素-FAK-SRC通路促進(jìn)iCCA轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展（圖3F）。進(jìn)一步分析表明，在BAP1Mut和IDH1/2Mut腫瘤中，ECM和膽汁分泌通路是相互激活的，而吞噬體、炎癥和MAPK通路僅在其中一種突變類型的腫瘤中被激活（圖3G和3H）。mRNA和蛋白水平上分析顯示熱點(diǎn)靶藥基因在TP53、KRAS、BAP1和IDH1/2突變?nèi)褐忻黠@富集（圖3I）。
圖3 驅(qū)動(dòng)基因突變對(duì)蛋白基因組圖譜的影響
4.與FGFR2變異和KRAS突變相關(guān)的磷酸化蛋白組學(xué)畸變
iCCA中FGFR2信號(hào)增強(qiáng)是由突變和染色體易位介導(dǎo)的。作者表明，所有FGFR2突變都位于激酶結(jié)構(gòu)域外（圖4A）。融合基因的FGFR2斷裂點(diǎn)(p.E767)相同，并保留其激酶結(jié)構(gòu)域（圖4B）。每種融合都通過(guò)熒光原位雜交進(jìn)行了驗(yàn)證（圖4C）。因?yàn)镕GFR2突變和KRAS突變可能會(huì)影響MAPK、PI3K-AKT-mTOR和Rho GTPase通路，作者探索了有和沒(méi)有這些變異的腫瘤中顯著改變的磷酸化位點(diǎn)及其相應(yīng)的蛋白表達(dá)，揭示了兩者磷酸位點(diǎn)的異常值（圖4D）。KRAS突變腫瘤表現(xiàn)出明顯的MAPK通路級(jí)聯(lián)激活，如MAPK14在T180和Y182上均磷酸化，MAP3K2在S514磷酸化，RPS6KA4在S343和T687磷酸化。相反，在FGFR2變異的腫瘤中，MAPK通路輕微下調(diào)，而Rho GTPase通路顯著上調(diào)（圖4E）。此外，F(xiàn)GFR2變異的腫瘤表現(xiàn)出顯著的PTPN11（Y62）和TLN1（Y70）酪氨酸磷酸化，在蛋白水平上觀察到相似趨勢(shì)（圖4F）。熱圖顯示FGFR2和PTPN11蛋白以及PTPN11 Y62磷酸化水平上調(diào)，伴隨著FGFR2變異的腫瘤中GRB2表達(dá)下調(diào)和S90磷酸化。值得注意的是，異常殘基Y62位于N-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域之間，此時(shí)磷酸化被認(rèn)為可以穩(wěn)定活性蛋白的構(gòu)象（圖4G和4H）。
圖4 FGFR2突變和KRAS突變對(duì)蛋白質(zhì)基因組學(xué)圖譜的影響
5.對(duì)來(lái)自FGFR2::BICC1融合的新表位和相應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行鑒定
對(duì)于兩個(gè)最常見(jiàn)的FGFR2::BICC1融合蛋白，利用跨越斷點(diǎn)殘基的序列建立了包含所有可能的8-10個(gè)氨基酸多肽的序列數(shù)據(jù)庫(kù)（圖5A）。通過(guò)四聚體交換實(shí)驗(yàn)，一組肽被成功地交換成HLA-A02:01和HLA-A24:02四聚體（圖5B），然后ELISPOT驗(yàn)證，CyTOF數(shù)據(jù)表明T細(xì)胞表型隨著多肽刺激發(fā)生進(jìn)化（圖5C）。偽時(shí)間分析顯示，T細(xì)胞逐漸活化，隨后分叉進(jìn)入記憶和耗盡2個(gè)分支，在成熟后期表現(xiàn)為兩種譜系；同時(shí)表達(dá)CD45RA（TEMRA）的效應(yīng)記憶T細(xì)胞亞群增加，尤其是效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）和pE2，而naive T細(xì)胞和中央記憶T細(xì)胞減少（圖5D）。因此，受多肽刺激的T細(xì)胞有效應(yīng)表型CD8+ T細(xì)胞顯著擴(kuò)增特征。進(jìn)一步TCR-seq顯示，在肽刺激后，供體2的TCR發(fā)生了顯著轉(zhuǎn)變。并對(duì)TCR克隆型的分布和TCR譜的相似性進(jìn)行分析（圖5E）。作者證實(shí)多肽32刺激供體2后TCR發(fā)生重排，并擴(kuò)增了多個(gè)頻率相對(duì)低的CDR3s（圖5F）。盡管供體間存在異質(zhì)性，但低頻率的新表位T細(xì)胞反應(yīng)為iCCA融合患者克服免疫編輯和耐藥性提供了有價(jià)值線索。
圖5 鑒定來(lái)自FGFR2:BICC1融合的潛在新表位及其對(duì)應(yīng)的T細(xì)胞表型
6.具有明顯生物學(xué)和臨床特征的蛋白質(zhì)亞群
用具有多種臨床、基因組、免疫學(xué)和微環(huán)境特征的1376個(gè)蛋白進(jìn)行聚類分析，作者發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞群（S1-S4）（圖6A）。S1中CD14、MPO、C5AR1等炎癥蛋白表達(dá)最豐富。S2與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞和ECM相關(guān)蛋白水平最高，包括FAP、POSTN和FLT1。S3是MAPK和代謝相關(guān)蛋白升高。S4粘附蛋白和膽道特異性蛋白表達(dá)最高（圖6B）。臨床上S1多為CA19-9水平升高、腫瘤壞死、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的腫瘤。S2有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。S3以HBV感染患者為主。S4主要富集于CA19-9水平較低、轉(zhuǎn)移較少的患者。4個(gè)蛋白質(zhì)亞群總生存期差異明顯（圖6C）。每個(gè)亞群都有不同的周期性變化的基因（圖6D），并對(duì)每個(gè)亞群中免疫檢查點(diǎn)、免疫標(biāo)志物和免疫細(xì)胞豐度進(jìn)行了分析（圖6E）。四個(gè)亞群的特異性標(biāo)志物MPO、POSTN、ALDOB和EPCAM分別代表炎癥（S1）、間充質(zhì)（S2）、代謝（S3）和分化（S4）（圖6F）。在FU-iCCA人群和驗(yàn)證人群中，通過(guò)多重免疫染色檢測(cè)的4個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)可以對(duì)患者生存情況進(jìn)行分層分析（圖6G）。
圖6 FU-iCCA人群中蛋白質(zhì)組學(xué)分層及相應(yīng)的分子和通路特征
7.蛋白質(zhì)組學(xué)預(yù)后生物標(biāo)志物的鑒定和驗(yàn)證
作者進(jìn)行監(jiān)督分析來(lái)確定預(yù)后生物標(biāo)志物，通過(guò)嚴(yán)格篩選發(fā)現(xiàn)19個(gè)預(yù)后良好蛋白和15個(gè)預(yù)后不良的蛋白（圖7A）。其中，HKDC1和SLC16A3分別是FU-iCCA人群中與患者生存呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的顯著因子（圖7B）。HKDC1和SLC16A3在4個(gè)蛋白質(zhì)亞群中表達(dá)差異顯著，S1中SLC16A3表達(dá)上調(diào)，S4中HKDC1表達(dá)上調(diào)（圖7C）。通過(guò)免疫染色檢測(cè)HKDC1低表達(dá)和SLC16A3高表達(dá)分別與預(yù)后差有關(guān)（圖7D）。與先前報(bào)道不同，HKDC1過(guò)表達(dá)降低了HuCCT1細(xì)胞的增殖、集落形成、葡萄糖消耗和糖酵解能力，支持其在iCCA細(xì)胞中的抗糖酵解/增殖作用（圖7E和7G）。正如預(yù)期，過(guò)表達(dá)SLC16A3的HuCCT1細(xì)胞表現(xiàn)出增殖快和集落形成能力強(qiáng)（圖7F），這可能是由于更強(qiáng)的糖酵解能力（圖7H）。
圖7 蛋白質(zhì)組學(xué)預(yù)后生物標(biāo)志物的鑒定和驗(yàn)證
結(jié)論：
本研究報(bào)道了262個(gè)iCCAs大規(guī)模蛋白質(zhì)基因組特征，包括WES、RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。根據(jù)WES數(shù)據(jù)，黃曲霉毒素特征被確定為主要的突變模式，通過(guò)損害基因組穩(wěn)定性、加速細(xì)胞周期和抑制免疫炎癥反應(yīng)，這可能有助于iCCA的病理發(fā)生。iCCA中TP53和KRAS共突變預(yù)后極差，轉(zhuǎn)移增加，可能通過(guò)整合素-FAK/SRC通路起作用。FGFR2融合和突變可能通過(guò)激活Rho GTPase通路而不是傳統(tǒng)的MAPK通路來(lái)促進(jìn)iCCA。這些發(fā)現(xiàn)可能為靶向這些特定的基因改變打開(kāi)新的治療機(jī)會(huì)。此外，來(lái)自FGFR2:BICC1融合的免疫原性多肽作為早期克隆發(fā)生，可能作為免疫原性靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)了四個(gè)亞群，為微環(huán)境改變提供更好的分層，這可能有助于亞群特異性免疫治療和靶向治療。HKDC1和SLC16A3是具有生物學(xué)功能的重要預(yù)后指標(biāo)，盡管這兩個(gè)生物標(biāo)志物都是糖酵解代謝的組成部分，但它們代表了兩種相反的預(yù)后方向，并可能指導(dǎo)iCCA患者不同的治療方法。
總之，綜合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和微生物組數(shù)據(jù)，確定了基因組和轉(zhuǎn)錄組分析未完全捕獲的潛在分子機(jī)制和疾病亞群，這些信息可能會(huì)為個(gè)性化靶向治療和免疫治療的發(fā)展開(kāi)辟新的途徑，最終使臨床實(shí)踐受益。希望本文所描述的結(jié)果和分析及相關(guān)數(shù)據(jù)，將為深入研究iCCA的癌變、進(jìn)展和治療提供豐富的資源。
參考文獻(xiàn)：Dong L, Lu D, Chen R, et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Cancer Cell. 2022,40(1):70-87.e15.
