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由于腫瘤的高度異質(zhì)性，研究腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制是非常具有挑戰(zhàn)性的。源自患者的類器官培養(yǎng)是研究癌癥分子機(jī)制的強(qiáng)大系統(tǒng)，并在乳腺癌、肺癌等多種癌癥的研究中得到廣泛應(yīng)用。今天小編就帶大家閱讀一篇在2022年4月28日發(fā)表在Genome Biology（IF：13.583）的文章，看看作者是如何結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序評(píng)估結(jié)直腸癌類器官模型的吧！
Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis
通過(guò)單細(xì)胞RNA-Seq分析對(duì)結(jié)直腸癌類器官系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估
一、摘要
從結(jié)直腸癌患者中建立源自患者的類器官，并對(duì)來(lái)自7名患者的成對(duì)樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA-Seq，以獲取類器官及其相應(yīng)的體內(nèi)腫瘤和正常組織。發(fā)現(xiàn)源自腫瘤組織的類器官忠實(shí)地概括了體內(nèi)癌細(xì)胞的主要基因表達(dá)特征。另一方面，來(lái)自正常組織的類器官在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平上表現(xiàn)出一些腫瘤樣特征，但在兩種培養(yǎng)基中都保留了正常的基因組特征，例如 CNV、點(diǎn)突變和正常的全局DNA甲基化水平。這些表明條件培養(yǎng)基在腫瘤上皮細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)中優(yōu)于化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。最后，相互交換了有機(jī)體的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)互換培養(yǎng)基后，有機(jī)體細(xì)胞基本保持了原來(lái)培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)錄組特征。
二、結(jié)果
結(jié)直腸癌類器官的建立和組織病理學(xué)表征
建立一組來(lái)源于多種類型的CRC患者的手術(shù)切除標(biāo)本的類器官培養(yǎng)物。其中包括7名CRC患者的7個(gè)腫瘤類器官培養(yǎng)物和7對(duì)相鄰的正常類器官培養(yǎng)物，并對(duì)其進(jìn)行了高精度的scRNA-Seq分析（圖1A)。其中4名患者的腫瘤和正常來(lái)源的類器官在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖1A）。與之前的研究一致，作者觀察到來(lái)自腫瘤組織的類器官比鄰近的正常來(lái)源的類器官呈現(xiàn)出更多樣化的形態(tài)（圖1B）。如圖1B所示，腫瘤類器官的形態(tài)從薄壁囊性到致密結(jié)構(gòu)不等。然后，對(duì)這些培養(yǎng)的類器官進(jìn)行了幾種上皮細(xì)胞的免疫熒光染色，結(jié)果表明，培養(yǎng)的類器官如預(yù)期的那樣表達(dá)了眾所周知的腸上皮細(xì)胞標(biāo)志物（圖1C）。
結(jié)直腸癌類器官的細(xì)胞類型組成
基于細(xì)胞的全局基因表達(dá)模式，將細(xì)胞分成三個(gè)簇，它們被注釋為上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞（圖1D-F）。發(fā)現(xiàn)體內(nèi)鄰近的正常組織和正常組織衍生的類器官主要由上皮細(xì)胞組成。免疫細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤組織中高度富集，但如預(yù)期的那樣在腫瘤衍生的類器官中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到（圖1G）。值得注意的是，化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基也可能促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈冋蓟瘜W(xué)成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的13.5%（圖1E-G）。此外，進(jìn)一步分析上皮亞型，共確定了7 種亞型。在整體范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與正常組織或源自正常組織的類器官相比，腫瘤組織或源自腫瘤的類器官具有更多百分比的干細(xì)胞樣細(xì)胞。此外，體外培養(yǎng)增加了正常來(lái)源的類器官中干細(xì)胞樣細(xì)胞的比例。它表明類器官主要由上皮細(xì)胞組成，這意味著體外培養(yǎng)傾向于富集上皮細(xì)胞。
相鄰的正常組織衍生的類器官在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平上表現(xiàn)出一些腫瘤樣特征
接下來(lái)，研究源自患者的類器官是否可以再現(xiàn)體內(nèi)腫瘤和鄰近正常組織的轉(zhuǎn)錄組特征。作者提取了體內(nèi)腫瘤和正常組織之間的差異表達(dá)基因 (DEG)，并分析了它們?cè)隗w外培養(yǎng)的類器官中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，體內(nèi)正常上皮細(xì)胞和體外正常組織來(lái)源的類器官上皮細(xì)胞均高度表達(dá)了幾種眾所周知的腸道標(biāo)志物基因（如 CLCA1、PYY、GCG、CA1、CLDN8 和 SI），這反映了正常組織衍生的類器官保持了體內(nèi)腸組織的特征性轉(zhuǎn)錄特征和細(xì)胞類型異質(zhì)性（圖2A）。正如預(yù)期的那樣，腫瘤衍生的類器官在體內(nèi)高度表達(dá)腫瘤特異性基因，其中許多已被廣泛報(bào)道與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，例如 PROCR、SCD、BMP4、CEACAM6、TESC 和 TGFBI（圖2A )。然而，正常組織衍生的類器官也高度表達(dá)了這些體內(nèi)腫瘤特異性基因的一部分（圖2A）。此外，對(duì)體內(nèi)組織切片和培養(yǎng)中的類器官進(jìn)行了腫瘤特異性基因CEACAM6的免疫熒光染色（圖 2B，C）。結(jié)果顯示CEACAM6在體內(nèi)僅由腫瘤細(xì)胞而非鄰近的正常組織高度表達(dá)（圖2B）。然而，培養(yǎng)中的腫瘤和正常組織來(lái)源的類器官均高度表達(dá)CEACAM6，證實(shí)正常組織來(lái)源的類器官獲得了結(jié)直腸癌細(xì)胞的一些基因表達(dá)特征（圖2C）。為了探究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是否也表現(xiàn)出類似的模式，因此在體內(nèi)和體外樣本中探索了腫瘤特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，與體內(nèi)正常上皮細(xì)胞相比，正常組織和腫瘤來(lái)源的類器官均顯示出體內(nèi)癌細(xì)胞特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖 3A）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，在RNA、蛋白質(zhì)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)水平，正常組織衍生的類器官在體外培養(yǎng)后獲得了一些腫瘤樣特征。
不同培養(yǎng)基之間的轉(zhuǎn)錄組特征比較
如圖1F所示，化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的細(xì)胞類型組成不同。因此，進(jìn)一步探討了這兩種培養(yǎng)基之間基因表達(dá)的差異。發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)靶基因AXIN2在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中高表達(dá)（圖3B）。此外，另一個(gè)Wnt信號(hào)靶基因WNT6主要由在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的正常組織來(lái)源的類器官表達(dá)（圖3B）。接下來(lái)，比較了不同培養(yǎng)基和體內(nèi)組織中上皮細(xì)胞的干/祖細(xì)胞標(biāo)記基因 (OLFM4) 和分化標(biāo)志基因 (CA2) 的表達(dá)（圖3C）。結(jié)果表明，在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官細(xì)胞與體內(nèi)相應(yīng)的上皮細(xì)胞保持了CA2和OLFM4的差異表達(dá)模式。在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，腫瘤組織來(lái)源和正常組織來(lái)源的類器官細(xì)胞混合在一起，CA2和OLFM4的表達(dá)沒(méi)有顯著差異，表明化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基有利于正常上皮細(xì)胞的干細(xì)胞樣特征，而不利于它們的分化/成熟特征（圖3C）。接下來(lái)，通過(guò)MKI67的表達(dá)測(cè)量了不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖。在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，正常組織衍生的類器官比腫瘤衍生的類器官具有更快的細(xì)胞增殖。另一方面，在條件培養(yǎng)基中，正常組織和腫瘤組織衍生的類器官顯示出相當(dāng)?shù)脑鲋陈剩▓D3D）。這表明化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基有利于正常上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而條件培養(yǎng)基一般對(duì)正常上皮細(xì)胞和癌癥上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有偏倚。
線粒體突變的譜系追蹤
使用線粒體突變，可以準(zhǔn)確區(qū)分體外培養(yǎng)的類器官是來(lái)自癌細(xì)胞還是來(lái)自單細(xì)胞分辨率的正常上皮細(xì)胞。例如，1號(hào)患者體內(nèi)的大多數(shù)癌細(xì)胞在6719_G、12948_T 和 7397_G 上具有腫瘤特異性線粒體突變（圖 4A）?；颊?1的所有正常組織衍生的類器官在這三個(gè)部位都是野生型的（圖 4A）。對(duì)于腫瘤衍生的類器官，來(lái)自Mix的一些細(xì)胞和來(lái)自O(shè)rg-1的所有細(xì)胞沒(méi)有腫瘤特異性突變，而來(lái)自 Org-2、Org-3 的大多數(shù)細(xì)胞具有腫瘤特異性突變（圖 4B）。這種現(xiàn)象可以用體內(nèi)腫瘤組織中同時(shí)存在癌細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞來(lái)解釋，并且它們都在體外生長(zhǎng)形成類器官。癌細(xì)胞在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中的增殖速度比正常上皮細(xì)胞的增殖速度慢得多（圖3D）。因此，接下來(lái)比較了在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官中癌細(xì)胞的比例。作者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)的腫瘤來(lái)源的類器官會(huì)丟失具有腫瘤特異性突變的細(xì)胞，這表明正常上皮細(xì)胞生長(zhǎng)更快，在體外培養(yǎng)期間，癌細(xì)胞逐漸被正常上皮細(xì)胞稀釋（圖 4A，H）。在條件培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)的類器官細(xì)胞保持腫瘤特異性突變，這表明癌細(xì)胞作為條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官的主要群體得到了保持（圖 4D，H）。條件培養(yǎng)基更適合正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞上皮細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。研究表明正常組織衍生的類器官表現(xiàn)出一些腫瘤樣特征，因此探索了所有患者上皮細(xì)胞中VIM和EPCAM的表達(dá)模式（圖4E）。發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)只有一小部分正常上皮細(xì)胞共表達(dá)VIM和EPCAM。然而，體內(nèi)的腫瘤上皮細(xì)胞以及來(lái)自正常組織和腫瘤組織的類器官都具有較高比例的共表達(dá)VIM和EPCAM的上皮細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光染色在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖4G）。這些證據(jù)表明體外培養(yǎng)可能有利于類器官中腫瘤細(xì)胞的部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特征。為了排除類器官培養(yǎng)過(guò)程中潛在的間充質(zhì)細(xì)胞污染，進(jìn)一步比較了這些 VIM+ 皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的VIM表達(dá)水平。結(jié)果表明，VIM+上皮細(xì)胞中VIM的表達(dá)水平僅為間充質(zhì)細(xì)胞的一半（圖4F）。因此，推測(cè)體外培養(yǎng)可能會(huì)促進(jìn)類器官中的EMT。
培養(yǎng)的類器官保留了體內(nèi)相應(yīng)組織的基因組和全局DNA甲基化特征
接下來(lái)，檢查了類器官中的突變和CNV，發(fā)現(xiàn)正常組織衍生的類器官不包含CNV或腫瘤特異性點(diǎn)突變。除了研究CNV和突變外，作者還研究了在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的體內(nèi)組織和類器官的整體DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)類器官可以維持體內(nèi)相應(yīng)組織的全局DNA甲基化水平。
類器官培養(yǎng)基的交換
為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖和干/祖細(xì)胞特征維持的差異是由不同的培養(yǎng)基引起的，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中更換了類器官的培養(yǎng)基，并對(duì)這些細(xì)胞并列進(jìn)行了高精度的單細(xì)胞RNA-Seq（圖5）。結(jié)果表明，類器官細(xì)胞在換用另一種培養(yǎng)基后，在原培養(yǎng)基中保持了OLFM4和CA2的表達(dá)模式（圖5A-B）。正常組織衍生的類器官和腫瘤組織衍生的類器官都高度表達(dá)體內(nèi)腫瘤特異性標(biāo)記基因CEACAM6（圖 5C 和 E）。此外，交換培養(yǎng)基不影響上皮細(xì)胞的基因組特征（圖5D、F）。
總結(jié)
作者在兩種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的體內(nèi)組織和相應(yīng)類器官進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，結(jié)合基因組和DNA甲基化組測(cè)序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地評(píng)估了類器官培養(yǎng)系統(tǒng)在分析結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生的分子特征方面的可靠性。生物信息大數(shù)據(jù)分析助力實(shí)驗(yàn)的工作正在如火如荼的開(kāi)展，感興趣的小伙伴千萬(wàn)不要錯(cuò)過(guò)了呦！
